Fluorescentie In situ Hybridisatie (FISH) Protocol in menselijk sperma

Summary

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe je een sperma monster proces om goede kwaliteit te bereiken fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie op de menselijke spermatozoa. Verkregen preparaten kunnen gebruikt worden voor aneuploidie screening in de context van de klinische diagnose.

Abstract

Aneuploïdieën zijn de meest voorkomende chromosomale afwijkingen bij de mens. De meeste van deze afwijkingen het gevolg zijn van fouten tijdens de meiose gametogene proces in de ouders. In de menselijke mannetjes, kunnen deze fouten leiden tot de productie van spermatozoa met numerieke chromosoomafwijkingen die een verhoogd risico van overdracht van deze afwijkingen aan het nageslacht te vertegenwoordigen.

Om deze reden heeft de techniek van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) op het sperma kernen wordt een protocol op grote schaal opgenomen in de context van de klinische diagnose. Deze werkwijze geeft een schatting van de frequenties van numerieke chromosoom afwijkingen in de gameten van de patiënten die zoeken naar genetische voortplanting advies.

Tot op heden, de chromosomen het vaakst opgenomen in het sperma FISH analyse zijn chromosomen X, Y, 13, 18 en 21.

Deze video-artikel beschrijft stap voor stap, hoe te verwerken en vast een menselijk sperma, hoe decondense en denatureren het sperma chromatine, hoe over te gaan tot zaadcellen visbereidingen te krijgen, en hoe u de resultaten op de microscoop zichtbaar te maken. Bijzondere opmerkingen van de meest relevante stappen worden gegeven aan de beste resultaten te bereiken.

Protocol

I. Voorbeeld verwerking en cel-fixatie Laat het sperma monster in steriele recipiënten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten totdat het vloeibaar maken. Breng het monster op een centrifugebuis en de spin het bij 1000g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant met behulp van een Pasteur pipet. Voeg hypotone oplossing (KCl, 0.075M) voorverwarmde bij 37 ° C, druppel voor druppel, terwijl het mengen op een vortex tot een uiteindelijk volume van 10 ml te…

Discussion

Dit protocol beschrijft hoe menselijk sperma monsters proces voor het verkrijgen van sperma visbereidingen. Met behulp van dit protocol is het mogelijk om chromosomale afwijkingen te analyseren in mannelijke gameten. Spermatozoa aneuploidie screening heeft toepassingen hetzij in het kader van fundamenteel onderzoek en in de reproductieve advies aan onvruchtbare mannen. Hoewel in de klinische diagnose van de meest bestudeerde chromosomen zijn X, Y, 13, 18 en 21, andere commerciële probes voor een breed scala van chromos…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Material	Roche	10197777001
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol	Material	Roche	10708976001
Acetic acid	Material	Merck	100.063
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit 20xSaline-Sodium Citrate 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI II) CEP 18/X/Y DNA probe NP-40 LSI 13/21 DNA probe	Material	Vysis Inc.	32-161075 30-805850 30-804941 30-171077 30-804820 30-171078
Centrifuge 5804R	Tool	Eppendorf
Centrifuge tube	Material	Nunc	347856
Coplin jar (glass)	Material	Barloworld Scientific	Hellendahl (ZCT278)
Coplin jar (plastic)	Material	Deltalab	191087
Cover slips (15×15)	Material	Knittel gläser	4600115
Cover slips (18×18)	Material	Knittel gläser	4600118
Diamond pencil	Material	Hammacher	335117010
Ethanol	Material	Merck	100.983
Formamide	Material	Roche	11814320001
Freezer	Tool	Zanussi
Gloves	Material	Sanyc	101/3300
HYBrite™	Tool	Vysis Inc.
Immersion Oil	Material	Olympus	35505
Incubator	Tool	Heraeus
Methanol	Material	Merck	106.009
Micropipette	Material	Labsystems	Finnpipette (4500000)
Micropipette replacement tip	Material	Daslab	16-2001
Nail varnish	Material	Quo-cosmetics
Olympus BX60 epifluorescence microscope	Tool	Olympus		Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red.
Pasteur Pipette	Material	Rubilabor	211.0230
Phase contrast microscope	Tool	Nikon Diaphot
Plastic pipette (3ml)	Material	Deltalab	200007
Potassium chloride (KCl)	Material	Fluka	60128
Rubber cement	Material	Best-test
Slides	Material	Knittel gläser	4520022
Slide Saver Boxes	Material	Deltalab	19276.1
Sterile container	Material	Deltalab	409726
Syringe	Material	PentaFerte	002022300
Thermometer	Material	Comark Instruments, Inc	KM12
Tri-distilled water	Material
Triton X-100	Material	Sigma	9002-93-1
Tweezers	Material	B/Braun	Aesculap (BD224R)
Vertical laminar flow hood	Tool	Burdinola	OR-ST 1500
Vortex mixer	Tool	Fisher Scientific	FB15012
Water bath	Tool	Raypa®