Fluorescência In situ Hybridization (FISH) Protocolo no esperma humano
Summary
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar uma amostra de sêmen para alcançar boa qualidade de fluorescência<em> In situ</em> Hibridação em espermatozóides humanos. Preparações obtidas podem ser usadas para triagem aneuploidia no contexto do diagnóstico clínico.
Abstract
Aneuploidias são as anormalidades cromossômicas mais freqüentes em humanos. A maioria destas anormalidades resultam de erros durante o processo de meiose gametogénicas nos pais. Nos machos humanos, estes erros podem levar à produção de espermatozóides com anormalidades cromossômicas numéricas que representam um maior risco de transmissão destas anomalias à descendência.
Por esta razão, a técnica de hibridização fluorescente di situ (FISH) em núcleos espermáticos tornou-se um protocolo amplamente incorporada no contexto do diagnóstico clínico. Esta prática fornece uma estimativa das freqüências de anormalidades cromossômicas numéricas nos gametas dos pacientes que procuram para aconselhamento genético reprodutivo.
Até à data, os cromossomos mais freqüentemente incluídos na análise FISH espermatozóides são cromossomos X, Y, 13, 18 e 21.
Este vídeo-artigo descreve, passo a passo, como processar e fixar uma amostra de sêmen humano, como decondense e desnaturar a cromatina de espermatozóides, como proceder para obter preparações FISH esperma, e como visualizar os resultados no microscópio. Observações especiais dos passos mais relevantes são dadas para alcançar os melhores resultados.
Protocol
Discussion
Este protocolo descreve como processar amostras de sêmen humano para a obtenção de preparações FISH esperma. Usando este protocolo, é possível analisar anormalidades cromossômicas em gametas masculinos. Espermatozóides triagem aneuploidia tem aplicações tanto no contexto da pesquisa básica e no aconselhamento reprodutivo dado a homens inférteis. Embora no diagnóstico clínico dos cromossomos mais estudados são X, Y, 13, 18 e 21, outras sondas comerciais para uma vasta gama de cromossomos e loci estão dis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Os autores agradecem a J. Blanco e F. Vidal para a sua supervisão e encorajamento, e Lucas J. para a sua assistência técnica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Material | Roche | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol | Material | Roche | 10708976001 | |
| Acetic acid | Material | Merck | 100.063 | |
AneuVysion® Multicolor DNA Probe Kit
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Material | Vysis Inc. | 32-161075
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| Centrifuge 5804R | Tool | Eppendorf | ||
| Centrifuge tube | Material | Nunc | 347856 | |
| Coplin jar (glass) | Material | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| Coplin jar (plastic) | Material | Deltalab | 191087 | |
| Cover slips (15×15) | Material | Knittel gläser | 4600115 | |
| Cover slips (18×18) | Material | Knittel gläser | 4600118 | |
| Diamond pencil | Material | Hammacher | 335117010 | |
| Ethanol | Material | Merck | 100.983 | |
| Formamide | Material | Roche | 11814320001 | |
| Freezer | Tool | Zanussi | ||
| Gloves | Material | Sanyc | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Tool | Vysis Inc. | ||
| Immersion Oil | Material | Olympus | 35505 | |
| Incubator | Tool | Heraeus | ||
| Methanol | Material | Merck | 106.009 | |
| Micropipette | Material | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Micropipette replacement tip | Material | Daslab | 16-2001 | |
| Nail varnish | Material | Quo-cosmetics | ||
| Olympus BX60 epifluorescence microscope | Tool | Olympus | Equipped with a triple-band filter for DAPI/Texas Red/FITC and single-band filters for Aqua, FITC and Texas Red. | |
| Pasteur Pipette | Material | Rubilabor | 211.0230 | |
| Phase contrast microscope | Tool | Nikon Diaphot | ||
| Plastic pipette (3ml) | Material | Deltalab | 200007 | |
| Potassium chloride (KCl) | Material | Fluka | 60128 | |
| Rubber cement | Material | Best-test | ||
| Slides | Material | Knittel gläser | 4520022 | |
| Slide Saver Boxes | Material | Deltalab | 19276.1 | |
| Sterile container | Material | Deltalab | 409726 | |
| Syringe | Material | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermometer | Material | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Tri-distilled water | Material | |||
| Triton X-100 | Material | Sigma | 9002-93-1 | |
| Tweezers | Material | B/Braun | Aesculap (BD224R) | |
| Vertical laminar flow hood | Tool | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Vortex mixer | Tool | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Water bath | Tool | Raypa® |
Riferimenti
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
