Qui si descrive un protocollo di base per la marcatura fluorescente di elementi diversi di tubi cuore da larve e adulti Drosophila melanogaster. Questi esemplari sono particolarmente adatti per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza o confocale. Questa tecnica permette una dettagliata analisi strutturale delle caratteristiche del cuore di un organismo modello potente.
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Articolo metodologico
Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture
In questo articolo
Sommario
Protocollo
Prima di iniziare
- Preparare le seguenti soluzioni:
- tampone rilassante (artificiale Drosophila emolinfa (ADH) (vedere "Visualizzare il cuore pulsante in Drosophila") che contiene 10 mM EGTA)
- fissativo (4% di formaldeide in 1x PBS)
- PBSTx (PBS contenente 0,1% Triton X-100)
- Opportunamente diluita anticorpi fluorescente primaria e secondaria specie-specifiche in PBSTx
- Sezionare Drosophila per esporre i tubi cardiaci (di mosche adulte e / o larve) a seguito di
- il semi-intatta Drosophila preparazione protocollo cuo....
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Discussione
Qui vi presentiamo un protocollo utile per la preparazione e la colorazione dorsale Drosophila melanogaster nave e dei relativi tessuti per l'imaging tramite microscopia a fluorescenza o confocale. Forniamo un resoconto sintetico dei passi da raffinate e comunemente impiegati nel nostro laboratorio per la colorazione efficace che permette ben risolta nella diagnostica per immagini in situ di larve e adulti tubi cuore Drosophila. Altri hanno descritto metodi simili in forma abbrevi.......
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano SI Bernstein (San Diego State University) per la lettura critica e utili suggerimenti per quanto riguarda la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni di NIH SI Bernstein, SDSU, e di R. Bodmer, BIMR, e da un post-dottorato dal Affiliato occidentale Stati della American Heart Association a G. Vogler e ad A. Cammarato.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Acido etilene glicole-bis(2-ammino-etil eter) -N,N,N’,N’-tetraacetico (EGTA) | Reagente | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldeide, 10%, priva di metanolo, Ultra Purificata | Reagente | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 falloidina | Reagente | Invitrogen | A12381 | |
| Mezzo di montaggio Vectashield® per fluorescenza con DAPI | Reagente | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Puntine di tungsteno | Reagente | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Portapuntine | Reagente | Fine Science Tools | 26018-17 |
Riferimenti
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
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Ristampe e permessi
