इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे बनाए रखने के लिए स्वस्थ, undifferentiated मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते).
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (HES) और निगरानी की जानी चाहिए क्रम में स्वस्थ, undifferentiated संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए परवाह. कम से कम, संस्कृतियों हर दिन खो पोषक तत्वों की भरपाई के लिए और अवांछित भेदभाव कारकों के मुक्त संस्कृतियों रखने के लिए एक पूरा मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन द्वारा खिलाया चाहिए. हालांकि भेदभाव की एक छोटी राशि स्टेम सेल संस्कृतियों में सामान्य और उम्मीद है, संस्कृति नियमित रूप से मैन्युअल रूप से हटाने, या "उठा" विभेदित क्षेत्रों द्वारा किया जाना चाहिए साफ है. पहचान और HES सेल संस्कृतियों से अधिक भेदभाव हटाने कक्षों की एक स्वस्थ आबादी के रखरखाव में आवश्यक तकनीकों हैं.
बाँझपन हर समय बनाए रखा जाना चाहिए जब HES कोशिकाओं के साथ काम कर रहे है. जैविक सुरक्षा कैबिनेट और उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों को स्वच्छ और बाँझ. सभी अभिकर्मकों पहले 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार फिल्टर का उपयोग कर का उपयोग करने के लिए फ़िल्टर्ड किया जाना चाहिए. HES सेल संस्कृति में antiboiotics का उपयोग आवश्यक नहीं है और बचा जाना चाहिए.
एक अलग वातावरण एक नामित उठा स्टेशन के रूप में स्थापना की जानी चाहिए. स्टेशन के लिए बाँझ बाड़े एक यूवी प्रकाश स्रोत, एक लामिना का प्रवाह डाकू, या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के साथ एक स्थिर बाड़े (जैसे एक पीसीआर कार्य केंद्र के रूप में) किया जा सकता है. उठा स्टेशन के अंदर एक विदारक माइक्रोस्कोप कालोनियों निरीक्षण के रूप में विभेदित क्षेत्रों को हटा रहे हैं की जरूरत है. एक स्थिर बाड़े या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के सामने ग्लास पैनल माइक्रोस्कोप के oculars के लिए अनुमति देने के लिए उचित airflow और बाँझपन समझौता किए बिना पैनल के माध्यम से विस्तार करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए.
स्वस्थ HES सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए, कोशिकाओं इष्टतम समय passaged हो आम तौर पर हर 4-7 दिन करना चाहिए,. इस समय कालोनियों अपने अधिकतम आकार तक पहुँच चुके हैं और मर्ज शुरुआत हो सकती है. विलय कालोनियों संस्कृति में भेदभाव की दर में वृद्धि कर सकते हैं. भाजित अनुपात 01:03 और 01:05 के बीच आम तौर पर गिरावट, मढ़वाया कालोनियों, विस्तार की दर, और संस्कृति की स्थिति की संख्या पर निर्भर करता है. Overplated कालोनियों (विभाजन का अनुपात बहुत कम है) की संभावना समय से पहले विलय और के लिए passaged होने की जरूरत से पहले वे अपने अधिकतम आकार तक पहुँचने.
एक MEF फीडर परत है कि अधिक से अधिक 2 सप्ताह पुराना है पर संस्कृतियों नए MEFs कि undifferentiated विकास और प्रसार का समर्थन करेंगे पर passaged चाहिए.
के बाद से भेदभाव HES सेल संस्कृतियों में स्वाभाविक रूप से होता है, एक छोटी राशि की उम्मीद है. गोपनीयता या अत्यधिक भेदभाव यदि संस्कृतियों को उचित देखभाल प्राप्त नहीं हो सकता है. कोशिकाओं को हर दिन खिलाया जाना चाहिए, मार्ग के बीच अतिवृद्धि बचा जाना चाहिए. हमेशा ताजा अभिकर्मकों का उपयोग करें. मीडिया MEFs, और अभिकर्मकों के सभी 14 दिनों के भीतर प्रयोग किया जाना चाहिए undifferentiated HES सेल के विकास से बचने के. अभिकर्मकों के नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट, FBS और MEFs, के रूप में नई बहुत है, से पहले जांच की जानी चाहिए उपयोग करने के लिए. याद रखें कि किसी विभेदित कोशिकाओं को हटा passaging नहीं पहले नए संस्कृतियों के लिए स्थानांतरित कर दिया जाएगा. इसके अलावा, 37 डिग्री सेल्सियस जब भी संभव कोशिकाओं को रखने की कोशिश. समय कोशिकाओं इनक्यूबेटर के बाहर खर्च करते हैं (जैसे खुर्दबीन मंच पर या जैविक सुरक्षा कैबिनेट में) एक गर्म खुर्दबीन मंच बहुत फायदेमंद हो सकता है अगर कोशिकाओं इनक्यूबेटर समय की विस्तारित अवधि के लिए किया जाएगा कर सकते हैं न्यूनतम.
जब खुर्दबीन के नीचे देख HES सेल संस्कृतियों, पहले समग्र गुणवत्ता और देखने के एक कम (2x या 5x) उद्देश्य शक्ति का उपयोग कर कालोनियों के आकार का आकलन. यदि संभावित विभेदित कोशिकाओं को कम सत्ता में मनाया जाता है, विभेदित आकारिकी एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य (10X) का उपयोग कर पुष्टि करें.
भेदभाव हटाने के तुरंत बाद, कालोनियों के किनारों दांतेदार या क्षतिग्रस्त प्रकट हो सकता है. ताजा माध्यम से रातोंरात कालोनियों सेते शेष undifferentiated कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं. संस्कृति में भेदभाव के प्रभाव के बिना, इन शेष कालोनियों के लिए आम तौर पर पैदा जारी रहेगा.
यदि संभव हो, कम बीतने HES कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों शुरू करते हैं. पहले और बाद में सभी प्रमुख प्रयोगों कोशिकाओं Karyotype.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
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D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
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PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipets | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20D | 9” glass |