Dieses Protokoll zeigt, wie man gesunde, undifferenzierte humane embryonale Stammzellen (ES-Zellen) zu halten.
Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) müssen überwacht und gepflegt werden, um gesunde, undifferenzierten Kulturen zu erhalten. Zumindest müssen die Kulturen täglich gefüttert, indem er umfassende Medium ändern, um verlorenen Nährstoffe wieder aufzufüllen und die Kulturen frei von unerwünschten Differenzierungsfaktoren zu halten. Obwohl eine kleine Menge der Differenzierung ist normal und erwartet in Stammzell-Kulturen, sollte die Kultur regelmäßig gereinigt werden, um manuell entfernen oder "picking" differenzierte Bereiche. Erkennen und Entfernen von überschüssigem Differenzierung von hES-Zell-Kulturen sind wesentliche Techniken in der Erhaltung einer gesunden Population von Zellen.
Sterilität muss jederzeit gewährleistet sein, wenn die Arbeit mit hES-Zellen. Reinigung und Sterilisation der biologischen Sicherheitswerkbank und alle Geräte vor dem Einsatz. Alle Reagenzien müssen gefiltert durch ein 0,22 um Filter mit einer Porengröße vor dem Gebrauch werden. Die Verwendung von antiboiotics in hES-Zell-Kultur ist nicht notwendig und sollte vermieden werden.
Eine separate Umwelt sollte als Designated Kommissionierplatz eingestellt werden. Die sterile Umhüllung für die Station kann eine statische Gehäuse (z. B. PCR-Workstation) mit einer UV-Lichtquelle, einer Sterilbank oder einer biologischen Sicherheitswerkbank werden. Ein Binokular in der Kommissionierung Station wird benötigt, um die Kolonien zu beobachten, wie die differenzierte Bereiche entfernt werden. Die Frontscheibe eines statischen Gehäuse oder einer biologischen Sicherheitswerkbank muss geändert werden, um für die Okulare des Mikroskops ermöglichen, um durch die Fenster, ohne eine ausreichende Belüftung und Sterilität zu verlängern.
Um gesund zu erhalten hES-Zell-Kulturen, müssen die Zellen zum optimalen Zeitpunkt passagiert werden, in der Regel alle 4-7 Tage. In dieser Zeit der Kolonien haben ihre maximale Größe erreicht und kann beginnen zu verschmelzen. Zusammengeführt Kolonien kann die Geschwindigkeit der Differenzierung in der Kultur zu erhöhen. Split-Verhältnisse in der Regel fallen 1.03 bis 01.05 Uhr, abhängig von der Anzahl der Kolonien plattiert, Expansionsrate und Kulturbedingungen. Overplated Kolonien (Split-Verhältnis zu niedrig) wird wahrscheinlich vorzeitig fusionieren und müssen passagiert werden, bevor sie ihre maximale Größe erreicht.
Kulturen auf einer MEF Feeder-Schicht, die mehr als 2 Wochen alt ist, muss auf neue MEFs dass undifferenzierte Wachstum und die Vermehrung Unterstützung passagiert werden.
Da die Differenzierung von Natur aus in hES-Zell-Kulturen, wird eine kleine Menge erwartet. Häufige oder starke Differenzierung kann auftreten, wenn die Kulturen nicht erhalten eine angemessene Pflege. Die Zellen zugeführt werden muß jeden Tag sein sollte Überwucherung zwischen Passagen vermieden werden. Verwenden Sie stets frischen Reagenzien. Alle Medien, MEFs und Reagenzien sollten innerhalb von 14 Tagen genutzt werden, um undifferenzierte hES-Zell-Wachstum zu vermeiden. New viele Reagenzien, wie Knockout Serum Replacement, FBS und MEFs, sollte vor gescreent werden, um zu verwenden. Denken Sie daran, dass alle differenzierten Zellen nicht vor Passagierung entfernt, um den neuen Kulturen übertragen werden. Versuchen Sie auch, die Zellen bei 37 ° C, wann immer möglich zu halten. Minimieren Sie die Zeit der Zellen verbringen außerhalb des Inkubators (zB am Mikroskop der Bühne oder im biologischen Sicherheitsschrank.) Ein beheizter Mikroskoptisch kann sehr vorteilhaft, wenn die Zellen des Inkubators für längere Zeit sein.
Bei der Betrachtung der hES-Zell-Kulturen unter dem Mikroskop, zunächst zu prüfen, die Qualität und Größe der Kolonien Blick mit einem Low-Power-(2x oder 5x) Ziel. Wenn potentiell differenzierten Zellen bei geringer Leistung beobachtet werden, bestätigen die differenzierte Morphologie mit einer höheren Vergrößerung Objektiv (10-fach).
Sofort nach dem Entfernen Differenzierung, können die Ränder der Kolonien gezackt oder beschädigt. Inkubieren Sie die Kolonien über Nacht in frisches Medium, damit die verbleibenden undifferenzierte Zellen sich zu erholen. Ohne den Einfluss der Differenzierung in der Kultur, werden diese verbleibenden Kolonien weiterhin normal vermehren.
Wenn möglich, beginnen Experimente mit low-Passage hES-Zellen. Karyotyp der Zellen vor und nach alle wichtigen Experimente.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
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D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipets | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20D | 9” glass |