Snelle en gevoelige colloïdaal Coomassie G-250 Kleuring voor Eiwitten in polyacrylamidegels
Summary
Deze video zal populariseren een colloïdale Coomassie G-250 kleuringsprotocol volgens Kang<em> Et al..</em> Voor de detectie van gemiddeld 4 ng eiwit in gels. De kleuring is binnen twee uur en zonder enige inspanning. We routinematig gebruik van Kang's protocol voor analytische doeleinden in gel op basis van proteomics.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) is een kleurstof gebruikt voor de visualisatie van eiwitten gescheiden door SDS-PAGE, het aanbieden van een eenvoudige procedure kleuren en een hoge kwantificatie. Bovendien is het volledig compatibel met massaspectrometrische eiwit identificatie. Maar ondanks deze voordelen, is het CBB beschouwd worden minder gevoelig dan zilver of fluorescentie kleuringen en dus zelden gebruikt voor de detectie van proteïnen in de analytische gel op basis van proteomics benadering.
Diverse verbeteringen van de oorspronkelijke Coomassie protocol 1 zijn gedaan om de gevoeligheid van de CBB te verhogen. Twee belangrijke wijzigingen werden ingevoerd om de detectie van lage-overvloedige eiwitten te verbeteren door het omzetten van de kleurstof moleculen in colloïdale deeltjes: In 1988, Neuhoff en collega's toegepast 20% methanol en hogere concentraties van ammonium sulfaat in het CBB G 250-gebaseerde kleuroplossing 2, en in 2004 Candiano et al.. opgericht Blue Silver met behulp van CBB G-250 met fosforzuur in de aanwezigheid van ammoniumsulfaat en methanol 3. Toch zijn al deze aanpassingen maar laat een detectie van ongeveer 10 ng eiwit. Een breed fameless protocol voor het colloïdale Coomassie kleuring werd gepubliceerd door Kang et al.. In 2002, waar ze aangepaste colloïdaal CBB Neuhoff's kleuringsprotocol ten aanzien van de complexvormers stoffen. In plaats van ammoniumsulfaat ze gebruikt aluminiumsulfaat en methanol werd vervangen door de minder toxische ethanol 4. De nieuwe aluminium-gebaseerde vlekken in de studie van Kang's toonde superieure gevoeligheid die detecteert zo laag als 1 ng / band (fosforylase b) met weinig gevoeligheid variëren afhankelijk van eiwitten.
Hier tonen we de toepassing van het protocol Kang's voor een snelle en gevoelige colloïdale Coomassie kleuring van eiwitten in analytische doeleinden. We illustreren de snelle en gemakkelijke protocol met behulp van twee-dimensionale gels routinematig uitgevoerd in onze werkgroep.
Protocol
Discussion
Innovatieve of gewoon een andere Coomassie protocol?
Op dit moment bestaan er verschillende protocollen voor kleuringen met Coomassie Brilliant Blue. De meesten van hen het gevolg zijn van kleine of grote wijzigingen van een van de meest gebruikte protocollen door Neuhoff en collega's 2. Ook Kang's protocol op basis van formule Neuhoff's. Maar is het echt een alternatief Coomassie kleuring methode voor proteomics onderzoek? We zullen foto twee belangrijke kwestie…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Nicola Wiethölter voor de voorbereiding en kleuring van een D-gels.
Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 tot ND en SM) en ondersteund door een onderzoeksbeurs van de Jürgen Manchot Stiftung te ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Riferimenti
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
