Een cel dood-gebaseerde test voor het PTI in Nicotiana benthamiana planten is beschreven.
Waar te nemen potentiële ziekteverwekkers in hun omgeving, planten gebruiken patroonherkenning receptoren (PRRS) aanwezig op hun plasma-membranen. PRRS herkennen bewaard microbiële eigenschappen genoemd pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en deze detectie leidt tot PAMP-triggered immuniteit (PTI), die effectief kolonisatie van plantaardige weefsels voorkomt door niet-pathogenen 1,2. De meest bestudeerde systeem in PTI is de FLS2-afhankelijke route 3. FLS2 erkent de PAMP flg22 dat is een onderdeel van bacteriële flagelline.
Succesvolle ziekteverwekkers bezitten virulentiefactoren of effectoren die kunnen onderdrukken PTI en laat de pathogeen de ziekte een te veroorzaken. Sommige planten op hun beurt hebben resistentiegenen die effectoren of hun activiteit, wat leidt tot effector-triggered immuniteit (ETI) 2 te detecteren.
Beschrijven we een celdood-gebaseerde test voor het PTI gewijzigd ten opzichte van Oh en Collmer 4. De test werd gestandaardiseerd in N. benthamiana, die wordt steeds vaker gebruikt als een modelsysteem voor de studie van plant-pathogeen interacties 5. PTI is veroorzaakt door infiltratie van een niet-pathogene bacteriestam in de bladeren. Zeven uur later, een bacteriestam die ervoor zorgt dat een ziekte of die activeert ETI is geïnfiltreerd in een gebied overlappen de oorspronkelijke infiltratie zone. PTI veroorzaakt door de eerste infiltratie in staat is te vertragen of te voorkomen de schijn van celdood als gevolg van de tweede uitdaging infiltratie. Omgekeerd, het uiterlijk van celdood in het overlappende gebied van inenting geeft een overzicht van PTI.
Vier verschillende combinaties van inductoren van PTI en uitdaging inentingen waren gestandaardiseerd (tabel 1). De test werd getest op niet-zwijgen N. benthamiana planten die diende als de controle-en planten zwijgen voor FLS2 die voorspeld worden aangetast in hun vermogen om PTI te ontwikkelen.
De celdood-gebaseerde test kan worden gebruikt om de betrokkenheid van een gen in PTI te bepalen. Zo kan het verlies-van-functie mutanten voor een gen van interesse worden getest met deze test. Van de vier combinaties van inductor en uitdaging inentingen gegeven in tabel 1, is het mogelijk dat slechts een combinatie kan resulteren in een fenotype in uw installatie achtergrond. We hebben gezien dat planten zwijgen voor FLS2 een specificatie van PTI in het Pf / DC en Pf/Q1-1 combinaties van inductor en uitdaging inentingen (tabel 1) laten zien.
Het is essentieel dat de milieu-omstandigheden voor de bepaling zo dicht mogelijk bij de beschreven in deel 3.1. Lage luchtvochtigheid veroorzaakt celdood om door te gaan te snel, waardoor de test moeilijk om te scoren. Als de voorwaarden zoals beschreven in ons protocol werken niet in uw laboratorium, probeer dan het veranderen van de hoogte van de inductor of uitdaging inenting. Een andere parameter die kan worden gewijzigd is de tijd tussen inductie en uitdaging, maar we hebben gemerkt dat de kortere tijd hiaten de oorzaak van de test af te breken te snel in controle planten.
We raden ten minste 4-5 planten worden getest in een experiment en een positief fenotype moet worden herhaald in minstens 3-4 onafhankelijke experimenten.
Wij danken Hye-Sook Oh, Joanne Morello en Alan Collmer, Departement Plant Pathologie en Plant-Microbe Biologie, Cornell University, voor waardevolle discussies. Wij danken Jesse Munkvold voor commentaar op het artikel. De financiering werd verstrekt door de National Science Foundation Plant Genome Program, award aantal DBI-0605059 (GBM).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
MES | Fisher Scientific | BP300-100 | Prepare as a1M stock, adjust pH and filter sterilize. Store at room temperature. | |
Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 730 |