Kvantitativa Phosphoproteomics i Fatty Acid Stimulerade Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Beskrivning av en kvantitativ fosforylering förfarande med cryolysis, urea solubilziation, HILIC fraktionering och iMac anrikning av fosforylerade peptider.
Abstract
Detta protokoll beskriver tillväxt och stimulans, med fettsyror oleat av isotopiskt tunga och lätta S. cerevisiae celler. Celler mals med hjälp av en cryolysis förfarande i en boll kvarn kvarn och de resulterande grindate bringas i lösning genom att urea lösningsgörande. Detta förfarande gör det möjligt att lys av cellerna i ett metaboliskt inaktiva tillstånd, bevara fosforylering och förebygga omorientering av phosphoproteome under cellslys. Efter sönderdelning alkylering, trypsin nedbrytning av de proteiner, är proverna desalted på C18 kolonner och provet komplexiteten minskas genom fraktionering med hydrofil interaktion kromatografi (HILIC). HILIC kolumner behålla företrädesvis hydrofila molekyler som är väl lämpad för phosphoproteomics. Fosforyleras peptider brukar eluera senare i kromatografiska profil än den icke fosforyleras motsvarigheter. Efter fraktionering är phosphopeptides berikad med immobiliserade metall kromatografi, som bygger på laddning-baserade affinitet för phosphopeptide anrikning. I slutet av detta förfarande proverna är klara för kvantitativt analyseras med masspektrometri.
Protocol
Discussion
Denna metod kommer att ge en anrikning av phosphopeptides som kan kvantitativt analyseras. Ett antal parametrar kan ändras i detta protokoll, men det viktigaste att komma ihåg är att bevara din fosforylering. Beredning av celler för kvantifiering kan uppnås på flera olika sätt, till exempel om du inte kan märka dina celler in vivo, taggar såsom ICAT [3] eller ITRAC [4] kan användas efter utvinning till differentiellt etikett två kulturer för kvantifiering syften.
För fr…
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Rich Rogers för tekniskt bistånd med masspektrometri analyser och hjälpsamma diskussioner, och Dr. Rob Moritz, Jeff Ranish och Hamid Mirzai för bra diskussioner.
Detta arbete har finansierats av NIH Centers of Excellence.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
Riferimenti
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
