תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.
פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.
שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול …
ברצוננו להודות לד"ר עשיר רוג'רס לקבלת סיוע טכני עם מנתח ספקטרומטריית מסה ודיונים מועיל, בני הזוג. רוב מוריץ, ג'ף Ranish ו חמיד Mirzai לדיונים מועילים.
עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי לבריאות של אקסלנס.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |