脂肪酸の定量的なPhosphoproteomicsは刺激を受けてサッカロマイセスセレビシエ</em
Summary
冷凍融解、尿素solubilziation、HILIC分画とリン酸化ペプチドのIMAC濃縮を用いた定量的リン酸化の手順の説明。
Abstract
このプロトコルは、同位体の重鎖および軽S.セレビシエ細胞の脂肪酸のオレイン酸、で、成長し、刺激を説明します。細胞は、ボールミルの粉砕機と尿素の可溶化により溶液に持ち込まれた結果grindateで冷凍融解の手順を使用して接地している。この手順では、リン酸化を維持し、細胞溶解中にリン酸化プロテオームの方向転換を防止する、代謝的に不活性状態で細胞の溶解が可能になります。還元、アルキル化、タンパク質のトリプシン消化後、サンプルをC18カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）を使用して分別削減サンプルの複雑さに脱塩されています。 HILICカラムには、優先的によくphosphoproteomicsに適した親水性の分子を保持する。リン酸化ペプチドは非リン酸化されたものよりクロマトグラフプロファイルは、後で溶出する傾向がある。分別した後、リン酸化ペプチドはリン酸化ペプチド濃縮用電荷ベースの親和性に依存している固定化金属クロマトグラフィーを、使用して濃縮される。この手順の最後にあるサンプルは、定量的質量分析法により分析する準備が整いました。
Protocol
細胞増殖とメディアその後、1.0のOD 600〜100mlリッチメディアで一晩BY4742Δarg4Δlys1細胞の単一コロニーを含む最小の酵母培地の二つ1リットルの培養（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない0.17％酵母窒素塩基、0.5％硫酸アンモニウム）にシードとリジン（13 C 6 15 N 2、Isotec）、同位体的に正常または重いアルギニン（Isotec 13 C <…
Discussion
このメソッドは、定量的に分析することができるリン酸化ペプチドの濃縮が得られます。パラメータの数は、このプロトコルに変更が、覚えておくべき最も重要な側面は、リン酸化を維持することですすることができます。定量化のための細胞の調製はin vivoであなたの細胞を標識することができない場合など、さまざまな方法で達成することができる、などICATのようなタグ[3]またはIT…
Acknowledgements
我々は、技術的な質量分析の解析と有用な議論の支援、そして博士のために博士リッチロジャースに感謝したいと思います。ロブサンモリッツ、ジェフRanish、および有用な議論のためのハミドMirzai。
この作品は、優秀のNIHセンターによって資金を供給された。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
Riferimenti
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Tags
Quantitative PhosphoproteomicsFatty Acid StimulationSaccharomyces CerevisiaeGrowth And StimulationOleateIsotopically Heavy And Light CellsCryolysis ProcedureBall Mill GrinderUrea SolubilizationMetabolically Inactive StatePhosphorylation PreservationPreventing ReorientationCell LysisReductionAlkylationTrypsin DigestionDesalting On C18 ColumnsSample Complexity ReductionFractionation Using Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)Phosphopeptides Elution ProfileImmobilized Metal ChromatographyCharge-based AffinitiesMass Spectrometry Analysis
Citazione di questo articolo
Saleem, R. A., Aitchison, J. D. Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (32), e1474, doi:10.3791/1474 (2009).