지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.
Abstract
이 프로토콜은 isotopically 무거운 가벼운 S. cerevisiae의 세포의 지방산 oleate와, 성장과 자극을 설명합니다. 세포는 볼 밀 분쇄기 및 요소의 solubilization에 의해 솔루션으로 가져온 결과 grindate에 cryolysis 절차를 사용하여 접지합니다. 이 절차는 인산화을 보존하고 세포 용해 동안 phosphoproteome의 reorientation 방지, metabolically 비활성 상태에있는 세포의 용해를 위해 수 있습니다. 감소, 알킬화, 단백질의 트립신의 소화에 따라, 샘플은 C18 컬럼과 친수성 상호 작용 크로마 토그래피 (HILIC)을 사용 분별화 감소 샘플 복잡 desalted 있습니다. HILIC 컬럼은 우선적으로 잘 phosphoproteomics 적합합니다 친수성 분자를 유지합니다. Phosphorylated 펩티드가 아닌 phosphorylated 대응보다 색층 프로필 나중에 elute하는 경향이있다. 분별화 후, phosphopeptides은 인산 농축에 대해 요금을 부과 기반의 동질성에 의존 고정화 금속 크로마 토그래피를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 이 절차의 뒷부분에있는 샘플은 양적 질량 분광법으로 분석 준비가 된 것입니다.
Protocol
Discussion
이 방법은 양적 분석 수 phosphopeptides의 농축을 얻을 것입니다. 매개 변수의 숫자는이 프로토콜의 변경,하지만 기억에 가장 중요한 부분은 인산화를 보존하는 것입니다 수 있습니다. 당신이 그토록 ICAT와 같은 생체내, 태그에 전지를 라벨 수없는 경우 부량에 대한 세포의 준비는 예를 들어, 다른 여러 가지 방법으로 얻을 수 [3] 또는 ITRAC [4] differentially 부량 두 문화를 라벨에 게시물을 추출을 …
Acknowledgements
우리는 질량 분석계 분석과 도움이 토론과 기술 지원 박사 서식 로저스 감사하고, DRS 것입니다. 롭 모리츠, 제프 Ranish, 그리고 도움이 토론에 대한 하미드 Mirzai.
이 작품은 우수의 NIH 센터 추진하는 사업.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
Riferimenti
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