Описание процедуры количественного фосфорилирования использованием криодеструкция, мочевина solubilziation, HILIC фракционирования и IMAC обогащения фосфорилированных пептиды.
Этот протокол описывает роста и стимулирования, с жирной олеиновой кислоты, изотопно-тяжелой и легкой клетки С. CEREVISIAE. Клетки местности с помощью криодеструкции процедура в мясорубку шаровой мельнице и в результате grindate приведены в растворе мочевины солюбилизации. Эта процедура позволяет лизис клетки в метаболически неактивное состояние, сохраняя фосфорилирования и предотвращения переориентации phosphoproteome во время клеточного лизиса. После сокращения, алкилирования, трипсина переваривание белков, образцы обессоленной на C18 колонны и образец сложности сократились на фракционирования использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC). HILIC колонн преимущественно сохраняют гидрофильных молекул, которые хорошо подходят для phosphoproteomics. Фосфорилированных пептиды, как правило, элюируются позднее в хроматографического профиля, чем не фосфорилированных аналогов. После фракционирования, фосфопептиды обогащенного использованием иммобилизованных металла хроматографии, которая опирается на заряд основе сродство к фосфопептидов обогащения. В конце этой процедуры образцы готовы к количественному анализу методом масс-спектрометрии.
Этот метод даст обогащение фосфопептидов, которые могут быть количественный анализ. Число параметров может быть изменен в данном протоколе, но самый важный аспект помнить, чтобы сохранить свои фосфорилирования. Подготовка клеток для количественной может быть достигнуто в несколько р…
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Богатые Роджерс для оказания технической помощи с масс-спектрометрии анализа и полезные обсуждения, и д-ра. Роб-Мориц, Джефф Ranish, и Хамид Mirzai за полезные обсуждения.
Эта работа финансировалась NIH Центры компетенции.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |