Um In vitro FluoroBlok Assay invasão tumoral

Summary

Este vídeo demonstra como medir a invasão celular por meio de inserções de cultura celular utilizando uma metodologia baseada em fluorescência.

Abstract

A marca de células metastáticas é a sua capacidade de invadir através da membrana basal e migrar para outras partes do corpo. Células devem ser capazes de secretar proteases tanto que quebram a membrana basal, assim como migrar a fim de ser invasivo. BD BioCoat Sistema de invasão do tumor fornece células com condições que permitam a avaliação de suas propriedades invasivas<em> In vitro</em^1,2. Consiste em um BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços com uma Placa Inserir micron membrana de poros 8,0 PET tamanho que tem sido uniformemente revestida com BD Matrigel Matrix. Esta camada uniforme de BD Matrigel Matrix serve como uma membrana basal reconstituída<em> In vitro</em> Proporcionando uma verdadeira barreira para não-invasivo de células ao apresentar uma estrutura de proteína apropriada para estudar invasão. O processo de revestimento oclui os poros da membrana, o bloqueio não-invasivo de células de migrar através da membrana. Em contraste, as células invasoras são capazes de se separar e migrar através da membrana revestida. Quantificação de invasão celular pode ser alcançado por qualquer rotulagem invasão pré ou pós-célula com um corante fluorescente, como CIID₁₂ (3) ou calceína AM, respectivamente, e medir a fluorescência das células invasoras. Desde o BD membrana FluoroBlok efetivamente bloqueia a passagem da luz 490-700 nm em> 99% de eficiência, fluorescente marcado células que não têm invadido não são detectados por um leitor de placa inferior leitura de fluorescência. No entanto, as células que invadiram a parte inferior da membrana não são mais protegidos contra a fonte de luz e são detectados com o leitor de placas respectivas. Este vídeo demonstra um ponto final do ensaio de invasão celular, usando calceína AM para detectar células invadidas.

Protocol

Pós-rotulagem e medição utilizando BD calceína AM corante fluorescente Células são rotulados para quantificação depois de terem invadido através do Matrigel BD Matrix e atravessou a membrana FluoroBlok BD. Como resultado, apenas a medição de ponto de extremidade de invasão das células podem ser obtidas. Cultivar células para ~ confluência de 80%. Preparar e hidratar o sistema de inserção. Remover o pacote de armazenamento de -20 ° C e deixe-o voltar à temperatura ambiente. Abrir a embalagem de alumínio e adicionar 500 mL quente (37 ° C) de mídia para o interior dos poços de inserção. Permitir que a placa para hidratar por 2 horas a 37 ° C, 5% CO 2. Nota: Não é necessário para reidratar o não revestido BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Sistema Insert que será usado como um controle de migração celular. Após a reidratação, remova cuidadosamente o meio dos poços de inserção sem perturbar a camada de BD Matrigel Matrix na membrana. O sistema está agora pronto para uso. Preparar suspensões de células por trypsinizing monocamadas de células e ressuspender as células no soro livre de DMEM com 5 x 10 4 células / mL. Nota: Se você estiver usando um tipo de célula diferente que você precisa para determinar a densidade de semeadura ideal. Para determinar a densidade de semeadura ideal para o seu tipo de célula em uma superfície porosa crescimento, use uma gama de densidades de semeadura (células / cm 2) que a densidade de semeadura suportes usados ​​em superfícies não porosas (ou seja, frascos, pratos e placas). Por exemplo, se você semente atualmente em 2,5 x 10 5 células / cm 2, as sementes em concentrações de células diferentes entre 5 x 10 4 e 5 x 10 5 células / cm 2 para determinar a densidade de semeadura ideal inicial. Adicionar 500 mL de suspensão de células (2,5 x 10 4 células) para as câmaras apical. Adicionar 750 mL de chemoattractant (5% FBS em DMEM) para cada uma das câmaras basal, usando as portas de amostra para o acesso. Incubar a BioCoat BD Sistema invasão tumoral e os não revestidos BD Falcon FluoroBlok 24 com vários poços Placa Insert para 20-22 horas a 37 ° C, 5% CO 2 atmosfera. Após a incubação, remova cuidadosamente médio das câmaras apical. Isso pode ser feito por flicking o conteúdo em um recipiente de resíduos. Não toque na superfície inferior do sistema de inserção. Transferir o sistema de inserção em uma placa de 24 poços contendo 500 mL segundo / poço de 4 mcg / ml em HBSS calceína AM. Incubar por 1 hora a 37 ° C, 5% CO 2. A solução calceína AM não é removido da câmara baixa antes da leitura de fluorescência, porque é um corante vital nonfluorescent que é convertido em calceína verde fluorescente por esterases citosólicas. Fluorescência das células invadidas é lido em comprimentos de onda de 494/517 nm (Ex / Em) em um leitor de placas de baixo para leitura fluorescente. O ajuste de ganho pode precisar de ser determinada empiricamente, mas um ganho de ponto médio deve ser um ponto suficiente para o arranque. Um ajuste de ganho que é muito alta pode levar a saturação do detector com amostra altamente fluorescentes, o que pode impedir a aquisição de resultados significativos. Uso de autogain (se suportada pelo seu leitor) não é recomendado. Um microscópio invertido de fluorescência pode ser usada para verificar os resultados, é especialmente útil para fazer isso na primeira vez que executar este ensaio. Nota: É de extrema importância que os Sistemas de Inserção são lidos usando o mapa da placa correta. Para obter informações sobre mapas placa de carregamento ver BD Boletim Técnico n º 436 em www.bdbiosciences.com ou BD contato com o Suporte Técnico (labware@bd.com). Orientação placa correta é com o bem A1 no canto superior esquerdo eo logotipo da BD Flacon orientada para a direita como a placa é inserido no leitor. Redução de dados Os dados são expressos como na seguinte equação: De fundo pode ser subtraído antes do cálculo da invasão celular por cento RFU = relativo unidades fluorescentes.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.