Vi presentiamo uno In vitro, Bicolore saggio fluorescenza per visualizzare la fusione di particelle virali singolo con un doppio strato obiettivo fluido. Mediante l'etichettatura particelle virali con fluorofori che macchia in modo differenziato la membrana virale e il suo interno, siamo in grado di monitorare la cinetica di hemifusion e formazione di pori.
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Articolo metodologico
Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fusione della membrana è un passo essenziale durante l'immissione di virus con involucro in cellule. Saggi di fusione convenzionale tipicamente rapporto su un gran numero di eventi di fusione, il che rende difficile analizzare quantitativamente la sequenza delle fasi molecolari coinvolti. Abbiamo sviluppato un in vitro, a due colori saggio a fluorescenza per monitorare la cinetica di fusione singole particelle virali con un doppio strato obiettivo su un supporto essenzialmente fluido.
L'influenza delle particelle virali sono incubati con un fluoroforo verde lipofile di macchiare la membrana e un fluoroforo rosso idrofilo per colorare l'interno virale. Abbiamo un deposito gangliosidi contenenti doppio strato lipidico sul destrano-functionilized superficie di vetro di una cella a flusso, incubare le particelle virali nel doppio strato planare e l'immagine della fluorescenza di un x 100 100 micron 2 Superficie, contenente diverse centinaia di particelle, su un CCD fotocamera. Per immagini sia la fluorescenza rossa e verde, siamo in grado di monitorare contemporaneamente il comportamento del colorante membrana (verde) e il contenuto acquoso (rosso) delle particelle.
Su abbassando il pH ad un valore al di sotto del pH fusione, le particelle si fondono con la membrana. Hemifusion, la fusione dei foglietto esterno della membrana virale con il foglietto esterno della membrana bersaglio, sarà visibile come un cambiamento improvviso della fluorescenza verde di una particella. Al momento della fusione dei due successivi volantini rimasti distale un poro sarà formata e il rosso che emettono fluoroforo nella particella virale sarà rilasciato sotto la membrana di destinazione. Questo evento darà luogo ad una diminuzione della fluorescenza rossa delle singole particelle. Infine, la fluorescenza integrato da un pH-sensibile fluoroforo che è incorporato nella membrana di destinazione indica il momento esatto della caduta di pH.
Dai tre fluorescenza in tempo le tracce, tutti gli eventi importanti (calo del pH, lipidi miscelazione su hemifusion, i contenuti di miscelazione sulla formazione dei pori) possono ora essere estratte in modo diretto e per ogni particella singolarmente. Raccogliendo i tempi trascorsi per le transizioni diverse per molte singole particelle in istogrammi, possiamo determinare la durata degli intermedi corrispondenti. Anche intermedi nascosti che non hanno un diretto osservabile fluorescenti possono essere visualizzati direttamente da questi istogrammi.
Protocollo
Vetro di copertura funzionalizzazione slittamento
Il doppio strato planare utilizzata nel test di fusione è supportato da un film idrati di destrano. Destrano funge da distanziatore tra il doppio strato planare e superficie di vetro. Questo impedisce che i componenti della membrana di diventare bloccato sulla superficie del vetro e fornisce anche lo spazio in cui il contenuto di una particella virale può sfuggire alla fusione. Coprioggetto di vetro sono funzionalizzati con il trattamento con una resina epossidica silano, che ci permette di legame chimico destrano al vetro (Elender, et al. 1996).
- Disporre 25 coprioggett....
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Discussione
Preparazione di liquido e continuo doppi strati lipidici supportati può essere impegnativo. Tracce di contaminanti difetti di materiale o superficie impediscono la diffusione di doppi strati. Pulizia accurata e la deposizione di uno strato uniforme di destrano sono essenziali.
L'imaging prolungata di particelle di virus può candeggina le etichette fluorescenti o farli diventare inattivato. Foto-danni di questo tipo è ben noto nella bio-imaging e campi di singola molecola ed è generalment.......
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Ringraziamenti
Il lavoro è stato sostenuto da NIH concede AI57159 (a SCH) e AI72346 (a AMvO). SCH è un Howard Hughes Medical Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Quadrati di vetro coprioggetto Corning, 25 mm | Sigma-Aldrich | CLS286525 | |
| Lamine di silice fusa | Technical Glass | ||
| Portaoggetti per colorazione | Thomas Scientific | 8542E40 | |
| (3-glicidiossi-propil)trimetossisilano | Gelest Inc. | SIG5840.1 | |
| Destrano T-500 | Pharmacosmos | 5510 0500 4006 | |
| 1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (DOPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850375 | |
| 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina (POPC) | Avanti Polar Lipid, Inc | 850457 | |
| Colesterolo | Avanti Polar Lipid, Inc | 700000 | |
| N-((6-(biotinoil)ammino)esanoil)-1,2-di-esadecanoil-sn-glicerolo-3-fosfo–etanolammina, sale trietilammonico (biotina-X DHPE) | Invitrogen | B1616 | |
| Streptavidina coniugata con fluoresceina | Invitrogen | S-869 | |
| Disialoganglioside GD1a da cervello bovino | Sigma-Aldrich | G2392 | |
| Mini estrusore | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Filtri in membrana di policarbonato da 0,1 micron | Whatman, GE Healthcare | 800309 | |
| Dischi di drenaggio da 10 mm (supporti per membrana) | Whatman, GE Healthcare | 230300 | |
| Sale sodico di sulforodamina B | S1402 | ||
| Rodamina 110 ottadecilica (Rh110C18) | Vedi Floyd et al. 2008 per il protocollo di sintesi | ||
| Colonne desalatrici PD-10 | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Microscopio a fluorescenza Nikon | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Obiettivo Plan Apo TIRF 60x 1,45 NA | Nikon Instruments | ||
| Laser Ar/Kr Innova 70C Spectrum | Coherent Inc. | ||
| Pompa per siringa | Harvard Apparatus | 702213 |
Riferimenti
- Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers. Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).
- Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M.
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Ristampe e permessi
