Denaturierung Urea Polyacrylamidgelelektrophorese (Urea PAGE)
Summary
Denaturierung Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird verwendet, um Einzelstrang-DNA oder RNA getrennt bis zu einer Grenze von 500 Nukleotiden. Urea in Kombination mit Hitze denaturiert Proben und unstrukturierte Einzelstränge in der Gel-Matrix migrieren nach ihrem Molekulargewicht.
Abstract
Harnstoff-PAGE oder denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese beschäftigt 6-8 M Harnstoff, der sekundären DNA-oder RNA-Strukturen denaturiert und wird für die Trennung in einem Polyacrylamid-Gel-Matrix auf das Molekulargewicht eingesetzt. Fragmente zwischen 2 bis 500 Basen, mit einer Länge von Differenzen so klein wie ein single nucleotide können getrennt mit dieser Methode 1 sein. Die Migration der Probe ist abhängig von der gewählten Acrylamid-Konzentration. Ein höherer Prozentsatz von Polyacrylamid löst niedrigerem Molekulargewicht Fragmente. Die Kombination von Harnstoff und Temperaturen von 45-55 ° C während der Gel laufen zu lassen für die Trennung von unstrukturierten DNA-oder RNA-Moleküle.
Im allgemeinen wird diese Methode ist erforderlich, um zu analysieren oder zu reinigen Einzelstrang-DNA oder RNA-Fragmente, wie synthetisiert oder markierte Oligonukleotide oder Produkte aus der enzymatischen Spaltung Reaktionen.
In diesem Video-Artikel zeigen wir, wie die Vorbereitung und Ausführung der denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen. Technische Tipps enthalten sind, zusätzlich zu den Original-Protokoll 1,2.
Protocol
Discussion
- Die Band Schärfe hängt von mehreren Faktoren ab. Das Volumen der Probe für scharfe Banden geladen werden sollte, so klein wie möglich, also im Idealfall zwischen 1-5 pl. Allerdings können bis zu 15 ul geladen, die noch eine akzeptable Auflösung. Weniger Probenvolumen Ergebnisse in schärfere Banden.
- Die Band Qualität ist auch abhängig von der Gel-Dicke. Thinner Gelen, wie z. B. 0,75 mm zeigen bessere Ergebnisse als 1,5 mm dicken Gele.
- Die Form der Bänder können auch während der Gel-loading beeinflusst wer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Singapore Academic Research Council (ARC) [Förderkennzeichen 90/07] unterstützt. Wir danken radiodurans für die Unterstützung.
Riferimenti
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochimica. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. , (2001).
- . . PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual. , (2001).
