Denaturazione Urea elettroforesi su gel poliacrilammide (PAG Urea)

Summary

Denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea viene utilizzato per separare singolo filamento di DNA o RNA fino ad un limite di 500 nucleotidi. Urea in combinazione con i campioni di calore denatura e non strutturati singoli filamenti migrano all'interno della matrice gel in base al loro peso molecolare.

Abstract

PAGINA urea o denaturazione poliacrilammide gel elettroforesi urea impiega 6-8 M urea, che denatura il DNA o le strutture secondarie dell'RNA e viene utilizzato per la loro separazione in una matrice di gel di poliacrilammide in base al peso molecolare. Frammenti da 2 a 500 basi, con differenze di lunghezza piccolo come un singolo nucleotide, possono essere separati con questo metodo ^1. La migrazione del campione dipende dalla concentrazione di acrilamide scelto. Una percentuale più alta di poliacrilammide risolve frammenti di peso molecolare inferiore. La combinazione di urea e temperature di 45-55 ° C durante la corsa del gel consente la separazione del DNA non strutturati o di molecole di RNA.

In generale, questo metodo è necessario per analizzare o purificare DNA a singolo filamento o di frammenti di RNA, come oligonucleotidi sintetizzati o etichettati o prodotti da reazioni enzimatiche scissione.

In questo articolo mostriamo il video come preparare ed eseguire il gel di poliacrilammide denaturante di urea. Consigli tecnici sono inclusi, oltre ai ^1,2 protocollo originale.

Protocol

Il protocollo testo completo e dettagliato per questa procedura sperimentale è disponibile nei protocolli di corrente in Biologia Molecolare. Dettagliate passo-passo le istruzioni per il montaggio del panino gel e gel per apparecchi possono essere trovati sul sito web BioRad 3. Attrezzatura richiesta: Lastre di vetro (interno ed esterno) 10 celle cm: 10,1 x 7,3 cm (disco interno), 10,1 x 8,2 cm (piastra esterna), BioRad 20 celle cm: 20 x 20 cm (lastra interna…

Discussion

1. La nitidezza banda dipende da diversi fattori. Il volume di campione caricato per bande forte deve essere il più piccolo possibile, cioè idealmente tra 1-5 microlitri. Tuttavia, fino a 15 microlitri può essere caricato che assicura ancora la risoluzione accettabile. Meno volume risultati dei campioni in più nitide bande.
2. La qualità di banda dipende anche dallo spessore del gel. Diluente gel, come ad esempio 0,75 millimetri mostrano risultati migliori gel a 1,5 mm di spessore.
3. La forma delle bande può anche ess…