Lentivirus उत्पादन
Summary
Lentiviruses बनाने के लिए, मानव 293 कोशिकाओं में डीएनए वैक्टर ट्रांसफ़ेक्ट हैं. फसल के बाद और ध्यान केंद्रित सतह पर तैरनेवाला, वायरस टिटर एक प्रवाह cytometer के साथ प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है.
Abstract
शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीवित कोशिकाओं में जीन मुंह बंद करने की एक प्रणाली है. आरएनएआई में, जीन मुताबिक़ कम दखल RNAs के अनुक्रम में (siRNA) के बाद transcriptional राज्य में खामोश हैं. लघु बाल के लिये कांटा RNAs, siRNA के लिए व्यापारियों, lentivirus का उपयोग करते हुए, सेल प्रकार की एक किस्म में आरएनएआई के लिए अनुमति देता है व्यक्त किया जा सकता है. मानव इम्यूनो वायरस जैसे Lentiviruses, दोनों विभाजन और गैर विभाजित कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए सक्षम हैं. हम एक प्रक्रिया है जो पैकेज lentiviruses का वर्णन करेंगे. पैकेजिंग डीएनए वैक्टर से सक्षम वायरस की तैयारी करने के लिए संदर्भित करता है. Lentiviral वेक्टर उत्पादन प्रणालियों एक 'विभाजन' प्रणाली है, जहां प्राकृतिक वायरल जीनोम व्यक्तिगत सहायक प्लाज्मिड constructs में विभाजित किया गया है पर आधारित हैं. चार अलग वैक्टर में विभिन्न वायरल तत्वों की इस बंटवारे lentiviral जीनोम के आकस्मिक पुनर्संयोजन द्वारा एक प्रतिकृति – सक्षम वायरस बनाने का जोखिम कम हो. यहाँ, एक ब्याज और तीन पैकेजिंग वैक्टर shRNA (पी VSVG, pRSV, pMDL) युक्त वेक्टर transiently मानव 293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट हैं. कम से कम एक ऊष्मायन 48 घंटे की अवधि के बाद, वायरस युक्त सतह पर तैरनेवाला काटा है और ध्यान केंद्रित किया. अंत में, वायरस टिटर रिपोर्टर (फ्लोरोसेंट) एक प्रवाह cytometer के साथ अभिव्यक्ति के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
Protocol
Acknowledgements
सैंडलर अस्थमा बेसिक रिसर्च सेंटर (सब्रे)
सैंडलर फाउंडेशन
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T cells Penicillin-streptomycin Glutamine Phosphate-buffered saline FBS | Invitrogen | |||
| FuGENE 6 transfection reagent pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche | |||
| Bleach | Clorox | |||
| 10-cm cell culture dishes 96 well cell culture dishes | Falcon | 353003 | ||
| Multichannel pipette | Rainin | |||
| Filtered pipette tips | Rainin | |||
| 1.5ml Eppendorf tubes Syringe Syinge filter (0.45-μm) | Eppendorf | |||
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | |||
| Tissue culture incubator at 5% CO2 | Coulter | |||
| Beckman SW41T.I rotor | ||||
| Beckman ultracentrifuge | Beckman | |||
| Fluorescent microscope | Coulter | |||
| FACS Array | Beckman |
Riferimenti
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors.. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. . J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
