Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi
Summary
Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.
Abstract
Sadece hücresel düzeyde olayları ortaya çıkarmak ve doğrudan temel süreçleri araştıran, canlı hücrelerin mekanizmalarını içine tam fikir elde edilebilir. Yerine nispeten ham dökme topluluk ortalamanın ölçümler kullanılarak yapılan çalışmalarda tek sistemleri odaklanarak, biyolojik sistemlerin kayma karmaşıklığı Bugüne kadar çok talep olması kesin tek molekül deneyler neden oldu. Ancak, çok önemli süreçler, sadece bir düzeyinde yaşayan hücre ya da birkaç molekül oluşur; topluluk ölçümleri genellikle bu olayların stokastik ve heterojen doğası maske. Burada, gelişmiş optik mikroskop ve analitik görüntü analiz araçları kullanarak, tek bir canlı bakteri tek moleküllerin hassas bir hücre ve biyolojik makineleri işleyen moleküler kompleksler içinde dinamiklerini izleyebilirsiniz içinde proteinler izlemek için nasıl gösterilmektedir. Teknikleri fizyolojik doğrudan ilgili. Minimal pertürbatif ve biyolojik örnek çalışma altında non-invaziv ve yaşam malzemesi araştırmalar için tamamen uydurulmuş, biyofizik diğer tek-molekül yaklaşımlara hazır özellikleri. Buna ek olarak, biyolojik örneklerin hepsi doğal olarak ortaya daha belirgin olarak daha fazla protein üretmek için, daha sık ama daha az ideal bir yaklaşım karşı değiştirilmemiş hücre suşları ("genomik kodlama"), hemen hemen aynı seviyelerde floresan etiketli proteini üretmek okudu ("plazmid ifade"). Böylece, gerçek biyolojik örnekler ele alınacaktır doğal organizmalar için önemli ölçüde yakın ve gerçek fizyolojik süreçleri nedenle gözlemler daha uygun.
Protocol
Discussion
Bakım bu yana gergin bakteri bakarak "flagellar motorlar üzerine kesme" hücre işlevlerini bozabilir değil alınmalıdır. Oksijen tükenmiş olabilir hücreleri mikroskop lamı üzerine bir kez bir saat daha uzun kullanmak için önemlidir. Önemli bir optimizasyon en iyi mikroskop görüntüleme koşulları soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem yiyecek ve içecek bulmak için gerekli olabilir. Özellikle mikroskop sistemi için gerekli olan doğru yoğunluklu lazer uyarma tespit etmek için t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Prof. Judith Armitage (Oxford Üniversitesi, İngiltere) ve Prof. Conrad Mullineaux (Londra Queen Mary Üniversitesi, UK) grupları bakteri suşlarının tür bağışlar kabul etmiş oluyorsunuz. IMD Biyokimya Bölümü (Oxford Üniversitesi) ve OCISB tarafından ortaklaşa finanse edilen AR Mühendislik ve Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) DTC öğrencilikle tarafından finanse edilmektedir; ND Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) finanse edilmektedir; MCL Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu tarafından finanse edilmektedir.
Riferimenti
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
