Cariotipo è una tecnica semplice e utile ampiamente utilizzato per la rilevazione di alterazioni genetiche. Qui si descrive un passo dal protocollo passo per la preparazione diffusione cromosoma di cellule staminali embrionali umane per monitorare lo stato cromosomico di queste cellule mantenute in coltura.
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Articolo metodologico
Preparazione Stendere cromosomiche di cellule staminali embrionali umane per cariotipo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sebbene cellule staminali embrionali umane (hESC) hanno dimostrato di presentare un cariotipo diploide stabile 1, molti studi hanno riportato che in base alle condizioni cultura diventano inclini ad acquisire le anomalie cromosomiche come la aggiunta di interi o parti di cromosomi. Infatti, durante il lungo periodo la cultura, le alterazioni del cariotipo si osservano quando dissociazione enzimatica o chimica sono usati 2,3,4, mentre dissezione manuale di colonie per passaging mantiene un cariotipo stabile 5. Inoltre, cambiamenti nell'ambiente come la rimozione delle cellule alimentatore sembrano anche compromettere l'integrità genetica di hESC 3,6. Una volta che le alterazioni cromosomiche potrebbero influenzare la fisiologia cellulare, la caratterizzazione della integrità genetica di hESC in vitro è di fondamentale importanza hESC considerare come uno strumento essenziale negli studi di embriogenesi e test della droga. Inoltre, per futuri scopi terapeutici alterazioni cromosomiche sono una reale preoccupazione in quanto è frequentemente associata a carcinogenesi.
Qui vi mostriamo un metodo semplice e utile per ottenere alta qualità dei cromosomi si diffonde per la successiva analisi del cromosoma fissati dal G-banding, FISH, SKY o tecniche di CGH 7,8. Si consiglia di verificare lo stato cromosomico di routine con intervalli di 5 passaggi al fine di monitorare la comparsa di traslocazioni e aneuploidie
Priscila Britto e Rafaela Sartore contribuito in maniera uguale alla carta.
Protocollo
ATTREZZATURE
- Tessuto cultura incubatore, 37 ° C, 5% di CO 2
- Centrifuga
- Set di micropipettors (100, 100μL)
- Acqua del bagno 37 ° C
- Bagnomaria a 90 ° C a essere fonte di vapore d'acqua
- Microscopio a contrasto di fase
PRIMO PASSO
Trattando le cellule con Colcemid
In questa procedura abbiamo usato la linea hESC H9 colta su fibroblasti embrionali di topo (MEF) inattivato con Mitomicina C (Sigma) e mantenuti in DMEM/F12 (Invitrogen) integrata con la sostituzione ad eliminazione diretta il 20% di siero (KSR, Gibco)....
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Discussione
La preparazione degli spread cromosoma è un passo fondamentale per un'analisi efficace della situazione genetica delle cellule staminali embrionali da tecniche di routine come G-banding, e le tecniche più sofisticate come la FISH, SKY e CGH.
Questa procedura può essere applicata per molti tipi di cellule, variando il periodo di incubazione Colcemid, che dipende dalla durata del ciclo cellulare. Per le colonie di cellule staminali embrionali, aspettiamo 3 ore, mentre per corpi embrionali .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo da centrifuga da 15 ml | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Acido acetico glaciale | Isofar | 100 | |
| Metanolo | Isofar | 208 | |
| Cloruro di potassio (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Vetrino | Bioslide | 7105-1 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T4799 |
Riferimenti
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- M....
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Ristampe e permessi
