La preparazione e la cultura di espianti Lens Rat epiteliali per lo Studio differenziazione terminale

Summary

Espianti della regione centrale della lente epiteli ratto differenziare in modo sincrono quando coltivate in presenza di FGF-2. Microscopia a immunofluorescenza della presenza di tali culture possono fornisce informazioni romanzo sulla espressione genica e di segnalazione eventi associati a differenziazione terminale.

Abstract

La superficie anteriore della lente oculare è coperto da un monostrato di cellule epiteliali, che proliferano in una zona anulare alla base del corpo ciliare. A seguito di divisione, queste cellule migrano posteriormente, dove la diffusione dalla retina FGF induce a differenziarsi in una serie di cellule allungate posteriore in fibra ottica, che compongono la maggior parte della lente. Differenziazione delle cellule epiteliali in fibre lente lente può essere indotta in vitro da espianti coltura della regione centrale dell'epitelio anteriore in presenza di FGF-2. Espianti sono preparati da lenti di ratti neonati, rimuovendo la lente dall'occhio e di cogliere capsula del cristallino sul lato posteriore con una pinzetta dissezione. La capsula posteriore è poi delicatamente squarciato e premuto sul fondo di un piatto di plastica coltura di tessuti. Le regioni periferiche del espianto vengono rimosse con un bisturi e la zona centrale è poi coltivate in presenza di 100ng/ml FGF-2 per tutto il tempo 2-3 settimane, a seconda dei parametri da studiare. Dato che le cellule epiteliali in espianti in coltura differenziare in sincronia approssimativa per un periodo di giorni o settimane, la durata della segnalazione e l'espressione genica può essere determinata utilizzando tecniche molecolari, biochimiche e farmacologiche. Microscopia a immunofluorescenza è un potente coadiuvante a questi metodi, come dimostra la localizzazione subcellulare di proteine ​​di interesse e può rivelare le conseguenze fisiologiche di manipolazioni sperimentali delle vie di segnalazione.

Protocol

Parte 1: La rimozione di lenti

Materiali e reagenti:

1. Micro-dissezione forbici, curvo, consigli smussato, (come as.RS-5983, Roboz Surgical Instrument Co., Inc, Gaithersburg, MD), micro-dissezione pinzette, punta ricurva (come Roboz # RS5137).
2. Mezzo di sospensione: Medium 199 contenente 0,1% di albumina sierica bovina, 100 unità / ml di penicillina, streptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml di amfotericina B. I reagenti sono disponibili da Invitrogen, Carlsbad, CA.

Procedimento:

1. Euthanize ratti neonati (di età compresa tra 2-4 giorni) in conformità alle linee guida fornite dal National Institutes of Health, Bethesda, MD.
2. Rimuovere le palpebre con le forbici chirurgiche. Premere delicatamente con le pinzette ricurve ai lati opposti della cavità oculare per costringere l'occhio a rigonfiamento verso l'esterno. Fai una piccola incisione nella parte posteriore dell'occhio con le forbici. Premendo con le pinzette contro il lato dell'occhio opposto l'incisione, l'obiettivo e una piccola quantità di corpo vitreo allegati possono poi essere costretto attraverso la rottura, permettendo l'obiettivo di essere prelevati con una pinzetta curva. Si deve prestare attenzione a non rompere la capsula del cristallino.
3. Utilizzare le pinzette ricurve per trasferire le lenti per un piatto 60 millimetri di plastica coltura di tessuti contenenti 5 ml caldo, medio sterile sospensione.

Parte 2: Microdissezione di espianti

Materiali e reagenti:

1. Micro pinzette dissezione, 0,1 punte mm, (come Roboz RS-4976). Noi usiamo lega Dumostar a causa della flessibilità della punta, ma altre leghe di acciaio sono anche accettabili. Pinzetta con punte sottili di 0,1 mm non sono raccomandati, in quanto tendono a rompere o piegare durante questa procedura.
2. Sospensione medio (vedere la Parte 1)
3. Senza supplementi Ham F12 medio o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA)

Procedimento:

1. Le seguenti operazioni devono essere eseguite in un ambiente pulito, privo di correnti d'ambiente utilizzando strumenti sterili dissezione e medie sterile.
2. Utilizzando un microscopio stereo-dissezione, pulire le lenti di qualsiasi tessuto aderendo con le pinzette 0,1 mm punta e di trasferirli in un secondo piatto 60 millimetri cultura medio sterile contenente 5 ml di sospensione (questo modo è possibile ridurre la contaminazione). Con le pinzette, trasferire il numero desiderato di lenti per un piatto cultura 35 millimetri contenente 5 ml sterile, senza supplementi di media. (Spesso usiamo Ham F12 (Invitrogen) per questo passo, perché la concentrazione di colorante inferiore rende dissezione più facile, tuttavia, Medium 199 è anche accettabile Nessun antibiotici o altre aggiunte sono necessari in questa fase..) Come ben 12 espianti possono essere effettuate al centro di un piatto di queste dimensioni. Tuttavia, un piatto di 35 mm dovrebbe essere utilizzato anche se meno espianti verranno, perché gli strumenti di dissezione non possono essere manipolati facilmente in un piatto più piccolo. Trasferire il piatto contenente le lenti rimanenti per un tessuto cultura incubatore a 37 ° C fino a quando non sono necessari.
3. Identificare il lato posteriore del cristallino. Ci sono molti modi per riconoscere questo: 1) Il posteriore è più rotondo rispetto alle anteriori, che è leggermente appiattita, 2) le lenti a forma di ratto neonato cataratta freddo come si raffreddano a temperatura ambiente durante la dissezione. Se la cataratta freddo non ha completamente riempito la lente, il lato posteriore è il lato più lontano dalla regione opaca. Se l'opacità ha riempito la lente, il riscaldamento il piatto a 37 ° C per qualche minuto lo retromarcia. Il lato posteriore può essere identificato come le riforme cataratta sul raffreddamento. 3) Le vestigia della tunica lentis vasculosa possono essere visibili sul lato posteriore. 4) La sutura posteriore può essere visibile sul lato posteriore. Identificare il lato posteriore correttamente è fondamentale, poiché è qui che la capsula sarà aperto. Aprendo la lente sulla parte anteriore si strappa l'epitelio.
4. Una volta che il lato posteriore è stato identificato, si volta verso l'alto e afferrare la lente le pinzette sinistra (per un destrorso lavoratore). Poi un pizzico della capsula posteriore con la pinzetta diritto di produrre una piccola piega.
5. Mentre si tiene la capsula posteriore con le pinze a destra, afferrare la piega della capsula con le pinze sinistra e tirate le due paia di pinzette in direzioni opposte per fare un piccolo strappo nella capsula.
6. Mentre afferrare il bordo della capsula retrattile con le pinze, tirarlo verso il basso, prima da una parte, poi dall'altra, premendo in plastica del piatto con la pinzetta. Ripetere questa operazione diverse volte, spostando tutto il equatore della lente, fino a quando la capsula è saldamente attaccato alla piastra in molti punti. Tenendo la capsula in posizione con le pinzette sinistra, agitare delicatamente la massa di fibre con la pinzetta diritto di rompere l'attaccamento tra le cellule delle fibre e le cellule epiteliali all'equatore lente. Quindi spingere la massa di fibre di distanza, rotolare fuori della capsula / epitelio, che rimane attaccato al fondo dellapiatto. Continuare questo processo con tutti gli obiettivi nel piatto. Rimuovere e gettare le masse fibra (o salvarli congelati come fonte di proteine ​​lente per altri studi).

Parte 3: Microdissezione e la cultura di espianti centrale

Materiali e reagenti:

1. Sterili monouso bisturi, lama # 15, (Surgical Co. Cincinnati Cincinnati, OH)
2. Fosfato sterile salina tamponata con calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. Terreno di coltura: media Sospensione contenente 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. St Louis, MO).

Procedimento:

1. Usando un bisturi sterile, tagliare via l'epitelio periferici (PE), che contiene le cellule nelle prime fasi della differenziazione (Figura 1A), lasciando una piazza centrale di circa 2,0 millimetri di lato, composto da centrale, cellule epiteliali solo (CE) (Figura 1B).
2. Trasferire il piatto contenente il espianti centrale di un armadio biosicurezza. Lavare 3 volte con PBS sterile contenente calcio e magnesio e una volta con 1 ml di fresco, equilibrato (37 ° C, 5% CO ₂₎ mezzo di sospensione. Questi lavaggi ridurre notevolmente la probabilità di contaminazione.
3. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura per indurre la differenziazione ^1, e posizionare il espianti in un umidificata, colture di tessuti incubatore a 37 ° C, 5% di CO _2. Periodi di cultura può essere il più breve di poche ore o di estendere fino a due o tre settimane, a seconda del parametro oggetto di studio. Medio dovrebbe essere cambiato ogni due o tre giorni.

Parte 4: raccolta di espianti per l'analisi di eventi associati con differenziazione

1. Espianti di raccolta per l'analisi di proteine ​​o RNA

Materiali:

1. Pinzette Microdissecting
2. SDS Lysis Buffer o RNA dopo

Procedimento:

1. Al termine del periodo di incubazione, rimuovere il terreno di coltura.
2. Utilizzando il microscopio stereo-dissezione, allentare leggermente i bordi di ogni espianto.
3. Sollevare ogni espianto con le pinzette e trasferirlo in una provetta contenente circa tampone 100μl lisi SDS (per l'analisi delle proteine) o RNA-successivo (per l'analisi del RNA). Agitare la punta delle pinzette nella soluzione per garantire che l'espianto non si attacca alle pinzette.

2. Espianti di raccolta per immunofluorescenza

Materiali e reagenti:

1. Tampone fosfato di calcio e magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. Tampone fosfato (senza calcio e magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA)
3. 4% paraformaldeide (Bioproducts Boston, Worcester, MA)
4. Pinzette Microdissecting
5. Idrofobo pennarello
6. Vetrini per microscopio
7. 0,25% Triton X-100 in tampone fosfato salino.

Procedimento:

1. Sciacquare espianti brevemente in PBS contenente calcio e magnesio.
2. Fissare i tessuti con l'aggiunta di 4% paraformaldeide per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Togliere il fissativo e sostituire con tampone fosfato. Espianti fisso diventare un po 'rigida, permettendo loro di essere sollevato e trasferito alle diapositive di vetro per immunocolorazione.
4. Mettere una piccola goccia di PBS (senza calcio e magnesio) sulla diapositiva per posizionare il tessuto e prevenire il curling. Utilizzando le pinzette microdissecting, sollevare l'espianto e inserirlo nel menu della diapositiva. Senza toccare l'espianto, rimuovere con attenzione il liquido con uno stoppino di carta per appiattire l'espianto sul vetro e lasciare asciugare il tessuto in aria a temperatura ambiente per 3 a 5 minuti.

Figura 1 A. L'epitelio periferico esprime differenziazione specifiche proteine. L'espianto è stato mostrato immunostained per N-caderina subito dopo microdissezione. Espressione è visto in una banda di cellule nell'epitelio periferici, indicando che le cellule in questa regione hanno cominciato a differenziarsi. B. L'epitelio periferica può essere tagliata fuori per rimuovere le cellule che esprimono N-caderina e altre differenziazione specifiche proteine. L'anello rosso rappresenta l'ubicazione delle cellule che esprimono N-caderina, mentre la piccola piazza delineato in grigio rappresenta il quadrante dell'epitelio mostrato nel pannello di 1A. L'epitelio periferica può essere rimossa da quattro tagli di bisturi, lasciando una piazza centrale che contiene solo le celle che non hanno ancora cominciato a differenziarsi.

Discussion

L'obiettivo del sistema di ratto espianto è stato usato con successo da una serie di laboratori per studiare differenziazione terminale delle cellule epiteliali alle fibre lente lente ^21,3,4,5. Se esposto a FGF-2 a 100ng/ml il espianti inizierà a mostrare i cambiamenti nella segnalazione in pochi minuti ^6, con i cambiamenti nella morfologia e l'espressione genica che appaiono in sequenza nell'arco di diversi giorni ^3,4,5. Le culture rimanere vitali per 2-3 settimane se si ha cura di evitare contaminazioni.

Il espianti centrale descritte in questo protocollo sono particolarmente utili per lo studio della sequenza di eventi associati con la differenziazione, in quanto contengono pochi se le cellule che esprimono marcatori di differenziazione prima di FGF-2 si aggiunge ^1,5. Le cellule si differenziano in modo sincrono, come una coorte, il che rende possibile seguire l'andamento temporale di segnalazione e di eventi trascrizionali associati differenziazione. Espianti coltura per periodi di tempo diversi quindi fornisce precise informazioni temporali sugli eventi sequenza. Inibitori specifici possono essere aggiunti al mezzo di coltura per identificare vie di segnalazione rilevanti. Espianti possono essere utilizzati per analizzare l'espressione proteica mediante elettroforesi su gel SDS e immunoblotting o per analizzare l'espressione di mRNA specifico mediante RT-PCR. Proteine ​​gamma rendimenti 20-50 mg / espianto e la resa è di circa RNA 200-600 ng / espianto, a seconda della lunghezza del periodo di cultura. Siamo in generale che per ogni piatto 5-6 espianti fornirà sufficienti proteine ​​o RNA per analisi diverse. RNA da espianti possono essere utilizzati anche per la preparazione del DNA per valutare l'espressione genica mediante l'analisi microarray, in grado di identificare nuovi geni che potrebbero essere cruciali per la differenziazione. Espianti possono anche essere transfettate. Anche se l'efficienza di trasfezione è generalmente bassa, è sufficiente per il saggio geni reporter ^{4, 7, 8.} Microscopia a immunofluorescenza del espianti fornisce un utile complemento ai metodi biochimici per determinare la posizione subcellulare di proteine ​​di interesse. Così, la preparazione e la cultura di espianti lente ratto fornisce un sistema potente per lo studio lente differenziazione terminale nei mammiferi, che possono integrare in tecniche in vivo, come la generazione di topi transgenici e knock-out.