विधानसभा, लोड हो रहा है, और एक विश्लेषणात्मक ultracentrifuge नमूना सेल के संरेखण

Summary

विश्लेषणात्मक ultracentrifuge (नीलामी) नमूना सेल नमूना और संदर्भ बफर प्रयोगों के दौरान रखती है और उच्च वैक्यूम और 60,000 rpm के लिए रोटर गति को उजागर. इस वीडियो को विधानसभा लोड हो रहा है और एक नीलामी प्रयोग के इस बहुत ही महत्वपूर्ण घटक के संरेखण के लिए आवश्यक विस्तार करने के लिए कठोर ध्यान प्रदर्शन करेंगे.

Abstract

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.

This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum

Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.

This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

Protocol

नमूना सेल विधानसभा और टोक़ हम एक साथ 2 विंडो विधानसभाओं रखकर नमूना सेल निर्माण शुरू करते हैं. खिड़की में एक खिड़की धारक गैसकेट रखें. स्थिति विंडो धारक के अंदर खिड़की लाइनर (या यह कभी कभी एक खिड़की कुशन कहा जाता है) इतना है कि जहाज के उद्घाटन धारक के keyway विपरीत है. एक मामूली कोण पर, धारक विंडो में जगह खिड़की पर खिड़की धारक के प्रमुख तरीके के साथ मुंशी निशान aligning. नीचे प्रेस धीरे खिड़की के दोनों पक्षों पर बहुत किनारों पर. उचित सील और नमूना सेल की सटीक टोक़ सुनिश्चित करने के लिए, हम हल्के से कोट आवास गैसकेट और Spinkote स्नेहक के साथ पेंच अंगूठी. अपने अंगूठे और तर्जनी के बीच एक Spinkote की बहुत छोटी राशि बिखरा हुआ है. Spinkote की एक पतली, अदृश्य फिल्म के साथ पेंच अंगूठी धागे कोट. इसी तरह, आवास गैसकेट कोट. किसी भी दृश्य स्नेहक पोछो. एक खिड़की विधानसभा फिसलने से शुरू नमूना सेल विधानसभा, आप की ओर का सामना करना पड़ खिड़की के साथ, सेल आवास में आवास कुंजी के साथ keyway aligning से. आवास कुंजी के साथ centerpiece keyway संरेखित करें और इसे धीरे सेल के अंदर खिड़की विधानसभा के शीर्ष पर गिर. कभी उपकरण के किसी भी प्रकार का उपयोग करने के लिए सेल आवास में centerpiece धक्का. यह प्रयोगों के दौरान रिसाव में जिसके परिणामस्वरूप सी.पी. को स्थायी नुकसान का कारण बन सकता है. दूसरी खिड़की विधानसभा मुड़ें ताकि विंडो centerpiece की ओर का सामना करना पड़ रहा है, आप से दूर, आवास कुंजी के साथ keyway संरेखित करें और यह centerpiece के शीर्ष पर नीचे स्लाइड. शीर्ष पर आवास गैसकेट प्लेस, तो, तो एक पेंच की अंगूठी शब्द "आउट" दिखाई देता है. अपनी उंगलियों और एक संरेखण उपकरण का उपयोग करना, हाथ पेंच अंगूठी कस. यदि सी.पी. आसानी से आवास बैरल में स्लाइड नहीं करता है, पहले यह संरेखित करें, तो यह की चोटी पर दूसरी खिड़की विधानसभा जगह. खिड़की विधानसभा पर कोमल नीचे दबाव लागू करके, सेल आवास में एक ही समय में दोनों स्लाइड. इस तरह, हम सी.पी. पर सीधे दबाने से बचें. अब धूल एक प्रकार का वृक्ष, और उंगलियों के निशान के लिए सेल के अंदर देखने के लिए एक अच्छा समय है. तुम भी न्यूटन रिंगों से संकेत मिलता है कि वहाँ अभी भी सी.पी. और खिड़कियों के बीच हवा है नोटिस जाएगा. ये टोक़ लागू करने के बाद गायब हो जाएगा. पेंच अंगूठी और "बाहर" दिखाई शब्द के साथ, नमूना सेल सेल टोक़ कोलिट टोक़ स्टैंड के अंदर नीचे सभी तरह जगह है. जगह में टोक़ खड़े संभाल पर लगातार दबाव लागू करने के द्वारा सेल पकड़ो. एक सतत गति में 120-140 के बीच एलबीएस में पेंच अंगूठी कस लें. एक समायोज्य सुक्ष्ममापी टोक़ रिंच का उपयोग कर यदि यह / एलबीएस में 120-140 के बीच में सेट और पेंच अंगूठी कस रिंच "क्लिक" सेट टोक़ का संकेत तक पहुँच गया है. टोक़ खड़े संभाल रिलीज और ध्यान खिड़कियों को छू के बिना नमूना सेल निकालने के. लोड हो रहा है और नमूना सेल सील अवसादन वेग प्रयोगों के लिए, हम नियमित रूप से 12mm 200ul विंदुक का उपयोग centerpiece के प्रत्येक क्षेत्र में 400ul की मात्रा लोड. ऊपर और पेंच दिखाई अंगूठी पर शब्द "बाहर" पर लोड हो रहा है छेद के साथ एक नमूना सेल स्थिति. विंदुक टिप आधे रास्ते स्लाइड नीचे बायाँ centerpiece के क्षेत्र में छेद के माध्यम से लोड हो रहा है और धीरे धीरे संदर्भ समाधान के 200ul बांटना. एक बार दोहराएँ 400ul कुल. वही विंदुक टिप और उसी तकनीक का उपयोग करना, ध्यान से और धीरे धीरे नमूना समाधान के 400ul के साथ सही centerpiece के क्षेत्र को भरने. उल 150-180 के खंड अवसादन संतुलन प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन एक ही देखभाल और तकनीक का पालन किया जाना चाहिए. यह करने के लिए संदर्भ और नमूना समाधान के संस्करणों मैच निकटता के रूप में के रूप में संभव जरूरी है. विंदुक पर मजबूती विंदुक टिप फिटिंग, धीरे धीरे लोड हो रहा है और वितरण समाधान, लोडिंग बुलबुले से बचने और दोनों के रूप में संभव के रूप में बराबर मात्रा को ध्यान में रखते हुए सभी सहायता समाधान के लिए एक ही विंदुक टिप का उपयोग कर. प्रत्येक लोड हो रहा है यकीन है कि वे केंद्र टुकड़ा और एल्यूमीनियम आवास के बीच तैनात हैं बनाने के छेद में snugly 2 नए लाल आवास प्लग gaskets रखकर सेल सील. प्रत्येक आवास प्लग के साथ कवर. एक छोटे से फ्लैट सिर पेचकश के साथ हाथ कस. रोटर में नमूना सेल संरेखण रोटर लोड हो रहा से पहले, सुनिश्चित करें कि counterbalance मामला है कि नमूना सेल लीक में विपरीत स्थिति में 0.5 से अधिक नहीं जी नमूना सेल की तुलना में हल्का है. शून्य पर संतुलन के साथ बाहर शुरू करो. पहले नमूना सेल है कि सीबी विपरीत स्थिति में हो जाएगा वजन. धड़ा संतुलन नमूना सेल वजन घटाना है, तो, सीबी तौलना. Counterbalance की कुर्की छेद से वजन जोड़ना या घटाना. यकीन है कि वजन ऊपर से नहीं बहर. यह सुनिश्चित करें कि counterbalance अंतिम वजन 0.5 ग्राम के भीतर विपरीत नमूना सेल की तुलना में हल्का Reweigh. एक रोटर 4 जगह का प्रयोग, 4 की स्थिति में counterbalance इतनी जगह है कि सफेद तीर दिखाई देता है और टी में इशारावह केन्द्रापसारक बल की दिशा. यकीन है कि यह सभी तरह रोटर अंदर नीचे है. धीरे सेट पेंच, counterbalance के शीर्ष पर सिर्फ सफेद तीर से भर पाया, जकड़ना जब तक counterbalance दृढ़ता जगह में है, लेकिन अभी भी गठबंधन किया जा करने में सक्षम है. आवास के साथ संतुलित नमूना सेल स्थिति रोटर के केंद्र और पेंच दिखाई अंगूठी पर शब्द "बाहर" का सामना करना पड़ प्लग है. रोटर नीचे खोज, संरेखण उपकरण का उपयोग counterbalance पर शास्त्राी निशान साथ अंदर शास्त्राी निशान निशान रोटर के केंद्र को निकटतम पंक्ति. सेट पेंच कस जगह में गठबंधन counterbalance ताला. उसी तरह, रोटर पर 2 स्थिति में अंदर मुंशी निशान के साथ नमूना सेल मुंशी चिह्न संरेखित करें. अधिक जानकारी के लिए देख https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx

Discussion

उचित सेल विधानसभा, नमूना प्रविष्टि, रोटर में और कक्ष संरेखण उच्च गुणवत्ता नीलामी प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है. यह सच है, विशेष रूप से प्रयोगों है कि macromolecular अवसादन प्रोफाइल पर प्राप्त डेटा के एक बहुत विस्तृत विश्लेषण की आवश्यकता के लिए, उदाहरण के लिए, जब प्रोटीन बातचीत का अध्ययन और ट्रेस कुल मात्रा का निर्धारण. अक्सर प्रयोगात्मक स्थापना की गुणवत्ता और नीलामी अध्ययन से परिणाम की सटीकता और परिशुद्धता के लिए सीमित है. 3 – व्यावहारिक डिजाइन और नीलामी प्रयोगों के आगे निष्पादन पर जानकारी के लिए, एक संदर्भ देखें. व्यावहारिक स्थापना, सिद्धांत, और नीलामी प्रयोगों के डेटा विश्लेषण को कवर कार्यशालाओं हमारी प्रयोगशाला में एक वर्ष में दो बार स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान में आयोजित किया जा रहा है है. [4]

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
4-place Ti analytical rotor		Beckman Coulter	361964
Torque stand assembly		Beckman Coulter	361318
Cell alignment tool		Beckman Coulter	362340
Spinkote Lubricant		Beckman Coulter	306812
Counterbalance		Beckman Coulter	360219
Cell Housing kit		Beckman Coulter	334602
Window gasket		Beckman Coulter	327021
Window liner		Beckman Coulter	362329
Window, sapphire		Beckman Coulter	307177
Window, quartz		Beckman Coulter	301730
Window holder		Beckman Coulter	305037
12mm double sector Epon centerpiece		Beckman Coulter	306493
Cell plug gaskets		Beckman Coulter	327022
Cell housing plug		Beckman Coulter	362327