Den analytiska ultracentrifugen (AUC) prov cell innehåller prov och referens buffert och under experiment och utsätts för högt vakuum och rotor hastigheter upp till 60.000 rpm. Denna video kommer att visa de rigorösa uppmärksamhet på detaljer som behövs för montering, lastning och anpassningen av denna mycket viktiga del av en AUC-experiment.
Den analytiska ultracentrifugen (AUC) är ett kraftfullt biofysiska verktyg som tillåter oss att spela in profiler makromolekylära sedimentering under hög hastighet centrifugering. När väl planerade och genomförda, kan en AUC sedimentering hastighet eller sedimentering jämvikt experiment avslöjar mycket om ett protein i fråga om att storlek och form, prov renhet, sedimentering koefficient, oligomerisering stater och protein-protein interaktioner.
Denna teknik kräver dock en noggrann nivå av teknisk uppmärksamhet. Provkuvetterna hålla en sectored blickfång inklämt mellan två fönster församlingar. De är förseglade med ett vridmoment tryck på cirka 120-140 i / lbs. Referens buffert och prov laddas in i mittpunkten sektorer och sedan efter försegling, de celler exakt anpassat till en titan rotorn så att den optiska system för upptäckt skanna både prov och referens buffert i samma radiella väg mittlinjen genom varje mittpunkten sektorn samtidigt som roterar med hastigheter på upp till 60, 000 rpm och under mycket högt vakuum
Inte bara är riktigt prov cell montering kritisk, prov cellens komponenter är mycket dyra och måste vara korrekt vårdas för att säkerställa att de är i optimalt skick för att undvika läckage och brott under experiment. Hantera fönster noggrant, även för de minsta spricka eller repa kan leda till brott i centrifugen. Kontakten mellan mittpunkten och fönster skall vara så strama som möjligt, dvs ingen Newtons ringar ska vara synlig efter vridmoment trycket tillämpas. Damm, ludd, repor och oljor på antingen Windows eller höjdpunkten alla kompromisser denna kontakt och kan mycket lätt leda till läckage av lösningar från en sektor till en annan eller läcker ut från mittpunkten alla tillsammans. Inte bara är dyrbara prover förlorade, läckande av lösningar under ett experiment kommer att orsaka en obalans av trycket i cellen som ofta leder till krossade fönster och centerpieces. Dessutom måste ansluta packningar och pluggar bostäder vara säkert för att undvika lösningar som drog sig ur mittpunkten sektorn genom lastning hålen av de höga vakuum i centrifugen kammaren. Fönster liners och packningar skall vara fria från brott och sprickor som kan orsaka som resulterar i trasiga fönster.
Denna video kommer att visa våra rutiner prov cell montering, vridmoment, lastning och rotor anpassning för att minimera skador på komponenter, lösning läcker och brott under den perfekta AUC experimentet.
Korrekt cellen montering, prov in, och celljustering i rotorn är avgörande för hög kvalitet AUC experiment. Detta gäller i synnerhet för experiment som kräver en mycket detaljerad analys av de förvärvade uppgifter om profilerna makromolekylära sedimentering, till exempel när man studerar proteininteraktioner och bestämma spårmängder aggregat. Ofta kvaliteten på experimentuppställning är begränsande för den noggrannhet och precision av resultaten från AUC studien. Mer information om den praktiska utformningen och vidare genomförande av AUC experiment, se Referenser 1 – 3. Verkstäder som täcker praktiskt setup, teori och analys av data från AUC experiment hålls två gånger per år i vårt laboratorium vid National Institutes of Health [4].
Vi erkänner den forskning stöd från Interna forskningsprogram NIBIB, NIH.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
4-place Ti analytical rotor | Beckman Coulter | 361964 | ||
Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | ||
Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | ||
Spinkote Lubricant | Beckman Coulter | 306812 | ||
Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | ||
Cell Housing kit | Beckman Coulter | 334602 | ||
Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | ||
Window liner | Beckman Coulter | 362329 | ||
Window, sapphire | Beckman Coulter | 307177 | ||
Window, quartz | Beckman Coulter | 301730 | ||
Window holder | Beckman Coulter | 305037 | ||
12mm double sector Epon centerpiece | Beckman Coulter | 306493 | ||
Cell plug gaskets | Beckman Coulter | 327022 | ||
Cell housing plug | Beckman Coulter | 362327 |