تنقية سكان خلية معينة من قبل الإسفار الفرز الخلية المنشط (FACS)

Summary

لكثير من الدراسات العلمية التي تتطلب تحليلا والبيولوجية والكيميائية للسكان الخلية يجب أن تكون الخلايا في حالة عالية من النقاء. مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) هو الأسلوب الذي متفوقة في الحصول على خلايا نقي السكان.

Abstract

الدراسات التجريبية والسريرية غالبا ما تتطلب عالي النقاء السكان الخلية. FACS هو الاسلوب المفضل لتنقية السكان من النمط الظاهري الخلية المعروفة. معظم طرق أخرى للتنقية وتشمل بالغسل استنفاد تكمل ، وفصل حبة المغناطيسي. ومع ذلك ، FACS ديها العديد من المزايا أكثر من الأساليب الأخرى المتاحة. FACS هو الأسلوب المفضل عند الحاجة نقاء عالية جدا من السكان المطلوب ، عندما كان سكان الخلية المستهدفة يعبر عن مستوى منخفض جدا من علامة تحديد الخلية أو عند السكان تتطلب الفصل على أساس الكثافة علامة التفاضلية. بالإضافة إلى ذلك ، FACS هي التقنية الوحيدة المتاحة لتنقية عزل الخلايا استنادا إلى تلطيخ الداخلية أو بين الخلايا بروتين تعبير ، مثل علامة بروتين فلوري المعدلة وراثيا. FACS يسمح للتنقية من الخلايا الفردية القائمة على التفاصيل والحجم ومضان. من أجل تنقية الخلايا من الفائدة ، والملون لأول مرة مع fluorescently الموسومة الاجسام المضادة (ماب) ، التي تعترف علامات محددة على سطح الخلية المطلوبة للسكان (1). اختيار السلبية للخلايا غير ملوثين غير ممكن أيضا. FACS تنقية يتطلب تدفق عداد الكريات مع فرز القدرات والبرامج المناسبة. لنظام مراقبة الأصول الميدانية ، يتم تمرير الخلايا في التعليق كشرط تيار في قطرات مع بعضها تحتوي على خلية واحدة أمام ليزر. نظام الكشف عن مضان يكشف خلايا الفائدة استنادا المعلمات الفلورسنت محددة سلفا من الخلايا. الصك ينطبق تهمة إلى قطرة تحتوي على خلية من الفائدة ونظام كهرباء انحراف يسهل جمع قطرات المشحونة في أنابيب جمع المناسب (2). نجاح تلطيخ والفرز وبالتالي تعتمد بشكل كبير على اختيار علامات تحديد واختيار خريطة موقع. ويمكن تعديل معايير الفرز اعتمادا على شرط الطهارة والعائد. على الرغم من أن نظام مراقبة الأصول الميدانية يتطلب المعدات المتخصصة وتدريب الموظفين ، وهذا هو الأسلوب المفضل لعزل عالي النقاء السكان الخلية.

Protocol

قبل البدء في العملية ، في البنود التالية يجب أن يتم جمعها وإعدادها ل: جليد أنابيب مخروطية 15 مل لخلايا التلوين و× 12 ملم أنابيب تدفق 75 لتلطيخ الضوابط لون واحد. تلطيخ العازلة : الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 3 ٪ الجنين مصل العجل (FCS) ماصات FC كتلة (إذا لزم الأمر) ، وتلطيخ الأضداد. الأضداد تحتاج إلى معاير لتلطيخ الأمثل. التعويض الخرز العازلة التعليق : محلول الملح المتوازن للهانك (HBSS) + 25 + HEPES ملي FCS 3 ٪ التريبان الأزرق وعدادة الكريات خلية مصفاة (40 ميكرومتر نايلون) ويمكن استخدام نوعين من أنابيب جمع أ) 12 X 75 مم أنابيب البوليسترين (FCS يحتوي على 300 و 25 ميكرولتر HEPES ملم) أو ب) 15 مل أنابيب مخروطية الشكل (1 مل تحتوي على السفح HEPES + 25 مم) : أنابيب جمع. ويمكن استخدام أي وسيلة غنية مع تركيز المصل عالية لمجموعة من الخلايا التي تم فرزها. إنشاء تعليق خلية واحدة من السكان خلية البداية. اختياري : إثراء للسكان الخلية التي تريدها وسيلة لتنقية السائبة مثل استنفاد تكملة أو الفرز المغناطيسي. والميزة الرئيسية لتخصيب اليورانيوم الخطوة هو أنه يقلل من الوقت الفرز. يغسل مرة واحدة مع خلايا تلطيخ العازلة. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في تلطيخ العازلة عند تركيز تصل إلى 6 × 10 50 لتلطيخ كفاءة. اختياري : للحصول على الخلايا معربا عن مستويات عالية من FCR ، وكتلة مستقبلات باستخدام الأسلوب المناسب حظر. وهناك طريقة الاختيار هو استخدام خريطة موقع الذي يربط لFcγR على الجليد لمدة 10-15 دقيقة. هذه الأجسام المضادة متوفرة تجاريا. إضافة خريطة موقع مناسب (عند تركيز محدد سلفا) إلى وصمة عار للسكان الخلية المطلوبة واحتضان لمدة 20-30 دقيقة على الجليد في الظلام ، ثم يغسل مع اثنين من تلطيخ العازلة. اختياري : يلطخ مع صبغة حيوية ، مثل يوديد propidium ، يمكن أن تدرج على تمييز الخلايا الميتة (5). إذا متعددة الألوان تلطيخ لاستخدامه ، وهناك حاجة لضوابط لون واحد. نستخدم CompBeads دينار بحريني للتحضير الضوابط لون واحد باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. إذا لم تكن تستخدم الأجسام المضادة مترافق مباشرة ، كرر الخطوة 7 باستخدام الأجسام المضادة المناسبة الثانوية أو المتقارن Streptavidin. بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في مستنبت وتحديد تركيز الخلية باستخدام صبغة حيوية مثل الأزرق التريبان. ضبط خلية إلى تركيز 15-20 × 10 6 / مل. بالنسبة للسكان الخلية التي تشكل كتل ، والتي يمكن أن تسد الصك أثناء الفرز ، وتصفية الخلايا من خلال مصفاة. انشاء وتحسين فارز الخلايا. وتتنوع عملية إنشاء تدفق عداد الكريات اعتمادا على تصنيع ويحتاج إلى أن يقوم بها الأفراد المدربين بشكل مناسب. التوصيات العامة هي كما يلي : حدد فوهة المناسبة تبعا لنوع الخلية المراد فرزها. لأنواع عقيمة ، تعقيم الصك. أداء أداة مراقبة الجودة للتحقق من الخرز مع الليزر تعمل ، ومن الفرز بدقة. تثبيت الجهاز جمع المطلوبة وإعداد الجداول الجانبية. نظرة على الليزر الصك وكشف عن تشكيل لتحديد تسميات الفلورسنت التي يمكن استخدامها (دينار بحريني لدينا نظام مراقبة الأصول الميدانية الأغنية ثلاثة الليزر ويمكن الكشف عن ما يصل الى تسعة ألوان). مرة واحدة فإنه يتم تحديد ما سيتم استخدام تسميات فارز الفلورسنت على الخلية ، يمكن إجراء التعويض (كما هو موضح أدناه). أداء التعويض باستخدام عينة السيطرة السلبية والضوابط واحدة إيجابية. التعويض هو ضروري لإزالة التداخل بين اثنين من الطيف كاشفات. من المهم أن نلاحظ أن التعويض لا تخدع دليلا وتتأثر سلبا من قبل كيف علامات معينة الزاهية وصمة عار ، ومضان من الخلايا التي تألق ذاتي منخفض والتي يمكن أن تؤدي إلى قرار الفقراء بين السكان قاتمة وسلبية. للحصول على أفضل النتائج ، يجب أن يتضمن التصميم التجريبي باستخدام fluorochromes مشرق مع علامات التعبير التي لديها منخفضة أو التي ليس لديها نمط تلطيخ معروفة. وينبغي استخدام علامات الفصل التي توفر جيدة بين السكان الخلية ويتم التعبير عن غاية مع fluorochromes ثنائيات مثل تلك ولع الليزر الأحمر أو البنفسجي. التعويض لا يمكن أن يؤديها مع حبات التعويض ، والتي هي البوليسترين المجهرية الدقيقة التي اقترنت إلى الضد محددة للضوء سلسلة من كابا الإيج من الجرذان والفئران ، أو الجرذان / الهامستر. حبات سهلة وصمة عار ، وإشارة قوية وتوفر طريقة سهلة لإعداد ضوابط الملون واحد التي لديها fluorophore نفس العينات التجريبية. إعداد قالب يتضمن مؤامرة ثنائي المتغير لعرض مبعثر إلى الأمام (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) ، والمدرج واحد لكل ملون تألقي التي سيتم استخدامها. تشغيل أنبوب السيطرة السلبية وضبط مبعثر إلى الأمام (FSC) والتشرذم الجانب (SSC) لوضع السكان لسعر الفائدة على نطاق واسع. ضبط إعدادات PMT مضان لوضع السكان سلبية أو تألق ذاتي في الجزء الأيسر بكثير من الرسم البياني. سجل أنبوب السيطرة السلبية. تشغيل واحدة أنابيب مراقبة إيجابية وتسجيل بيانات كل أنبوب. رسم البوابة الفاصلة حول الجزء الإيجابي من البيانات الموجودة على المدرج ، وآخر البوابة الفاصلة على الجزء السلبي من المدرج. ويتم التعويض عن طريق ضبط الخط الناصف (المتوسط ​​هو أفضل تقدير للنزعة المركزية من الوسط على مقياس لوغاريتمي) من ايجابيات حتى يساوي وسيطة من السلبيات. ويجب أن يتم ذلك لكل من التسميات ملون تألقي المستخدمة في التجربة. لضبط وسيطة ، وضبط تداخل القيم الطيفية إما أعلى أو أقل حتى الوساطات عن كل مباراة المعلمة الفلورسنت قدر الإمكان. ويمكن أيضا أن يتم التعويض تلقائيا مع برامج التحليل. التعويض التلقائي يستخدم البيانات المسجلة من الضوابط التعويض لحساب مصفوفة الجبرية عن جميع fluorophores المستخدمة في التجربة. وتستخدم هذه القيم للطرح من مساهمات من الألوان غير الأساسية التي هي نزيف في الكشف عن لون الأساسي. سجل العينة التجريبية ليتم فرزها واستخدام أدوات وأساليب تبوب subsetting لتعريف السكان من الاهتمام. إعداد قالب تجريبية مع مؤامرة التي تعرض نقطة مقابل FSC SSC واستخدام أداة النابضة ، المضلع ، المستطيل ، الفاصل الزمني أو رباعي لبوابة السكان من الاهتمام. المؤامرة مبعثر يعرض الخصائص الفيزيائية للخلية التي تتميز إلى نوع من الخلايا. أفضل طريقة لتحديد استراتيجية تبوب الاستشعاع استخدام مضان ناقص واحد التحكم (FMO). التحكم في أنبوب FMO يتم تضمين كافة الكواشف المستخدمة في التجربة باستثناء واحدة من الفائدة. ويساعد FMO تميز بين السكان الملون بشكل خافت والسكان سلبية واسعة. استخدام البيانات المسجلة من أنابيب FMO لتحديد مكان وضع البوابات داخل أنبوب التجريبية. مرة واحدة وقد تم تحديد البوابات ، يمكن تحديد بوابات للفرز في أنابيب جمع الخارجية. يمكن فرز ما يصل إلى أربعة أبواب (أو السكان) في وقت واحد اعتمادا على الأجهزة المتوفرة. تشغيل أنبوب العينة التجريبية في 4 درجات مئوية ، بدوره على لوحات انحراف ، ونوع العينة. يمكن فرز 10 5 5 × -1.5 × 10 6 خلايا في أنبوب × 12 ملم 75 و 1.5 × 10 6-4،5 يمكن فرز × 10 6 الخلايا المخروطية الى 15 مل. مرة واحدة وقد تم الحصول على العدد المطلوب من الخلايا ، ووقف الفرز يدويا. إجراء تحليل بعد الفرز لتحديد نقاء السكان الخلية التي تم فرزها. ممثل النتائج وقد أظهرت النتائج لأننا هنا ب الماوس الطحال وCD4 فرز الخلايا التائية (الشكل 1). وكانت ملطخة Splenocytes تكساس مع PE الأحمر مترافق المضادة للماوس B220 ، TCRβ المضادة للماوس FITC – مترافق وAlexafluor – 700 – مترافق مكافحة CD4 الماوس لتحديد الخلايا B (B220 + TCRβ) CD4 T والخلايا (CD4 + + TCRβ ). تم إجراء الفرز مع صك دينار بحريني الأغنية FACS. بعد فرز الخلايا B والنقاء> كان 97 ٪ والخلايا التائية CD4 الطهارة> 98 ٪. الشكل 1. نقاء خلايا الطحال وباء CD4 T الخلايا بعد FACS. كانت ملطخة splenocytes الماوس المضادة للماوس TCRβ ، B220 والأضداد CD4. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا B باستخدام FACS دينار بحريني الأغنية التي تبوب على B220 + TCRβ خلايا (الشكل 1A ، اللوحة اليسرى ، الربع السفلي الأيمن). وأجري تحليل لتحديد نوع آخر على نقاء الخلايا B (الشكل 1A ، اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ B220 على محور x وتلطيخ TCRβ على محور ذ. تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية للخلايا CD4 T باستخدام نفس تدفق عداد الكريات تبوب على TCRβ خلايا CD4 + + (الشكل 1B ، اللوحة اليسرى ، رباعي العلوية اليمنى). وأجري تحليل نوع آخر لتحديد نقاء الخلايا التائية CD4 (الشكل 1B ، اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ TCRβ على المحور x و CD4 تلطيخ على محور ذ. يظهر الخلايا إيجابية في المئة في كل رباعي. <!– الشكل 2. نقاء CD4 الطحال وقد أثرى الخلايا التائية بعد FACS. الفئران الخلايا التائية الطحال عن طريق إزالة الخلايا باء بحلول بالغسل. في وقت لاحق ، تم صبغ الخلايا المضادة للماوس TCRβ CD4 والأضداد (اللوحة اليسرى). تم تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام FACS دينار بحريني الأغنية التي تبوب على TCRβ + + خلايا CD4 (اللوحة اليسرى ، quadr اليمنى العلياالنمل). وأجري تحليل نوع آخر لتحديد نقاء الخلايا التائية ، التي كانت أكبر من 99 ٪ (اللوحة اليمنى). ويرد تلطيخ TCRβ على المحور x و CD4 تلطيخ على محور ذ. يظهر الخلايا إيجابية في المئة في كل رباعي. –>

Discussion

FACS هي تقنية متطورة للغاية لتنقية السكان خلية من الفائدة ، والتي يمكن من خلالها الحصول على درجة نقاوة عالية جدا (95-100 ٪) من السكان التي تم فرزها. لذلك ، هذه التقنية أهمية خاصة بالنسبة للتجارب ، حيث نقاء عالية شرط أساسي (على سبيل المثال ميكروأري التحليل). FACS هو مفيد خاصة خلال الأساليب الأخرى المتاحة للتنقية عندما السكان الخلية يحتاج إلى تنقية استنادا إلى السطح وأعرب علامة الأسبوعية أو عند اثنين أو أكثر من السكان بحاجة إلى تنقية التي لديها مستويات مختلفة من التعبير عن علامة السطح نفسه. على سبيل المثال ، منطقة هامشية تنقية الخلايا B (B220 ⁺ CD21 CD23 ^{INT مرحبا / منخفض)} ومسامي الخلايا B (B220 ⁺ CD21 ^{INT ​​/ منخفضة مرحبا} CD23) على أساس مستويات التعبير عن CD21 CD23 و. تطبيق آخر هو تزايد FACS احد الفرز الخلية مما يتيح للتحليل الخلايا الفردية (3 ، 4). كما FACS تستخدم عادة لفرز الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية التي أعرب وراثيا ، مثل البروتينات الخضراء بروتين فلوري الموسومة (5). يمكن إذا تم تنفيذ عملية الفرز تكون عقيمة مثقف الخلايا. ومع ذلك ، يمكن أن يتعرض للخطر بقاء الخلية والمحصول أثناء الفرز. ويمكن تحسين الجدوى باستخدام الخلايا التي تعتمد على درجة الحرارة المثلى لفرز ومعالجة الأنابيب بعد جمع فورا ان تصل القدرة. ويمكن زيادة الاسترداد باستخدام أنابيب جمع البولي بروبلين ، وجمع الخلايا مرتبة في وسائل الإعلام الغنية المصل وأنابيب جمع عكس بشكل متقطع ، والحفاظ على أنابيب جمع في درجة حرارة مثلى والطرد المركزي لخلايا فرز 10 دقيقة ~ (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

مددت تطوير فارزات عالية السرعة المتطرف في إمكانية تطبيق الفرز في ضبط تدفق السريرية. التطبيقات السريرية المحتملة تشمل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتنقية الدم من الخلايا الجذعية من الدم البشري لأغراض علاجية ، وتطبيقات في علاج السرطان ، واستبدال بزل ، فرز الحيوانات المنوية البشرية المكتشفة والمرض في وقت مبكر (6 ، 7).

لتلطيخ متعدد الألوان ، واختيار الأضداد هو خطوة حاسمة ، ويتم اختيار fluorochromes على أساس نظام الكشف عن كل وثيقة معينة. هناك عدد من الشركات التي تبيع فارزات الخلية ، ويختلف التكوين الليزر وفقا لاحتياجات المستخدم. وبالتالي لا يمكن للمرء ببساطة استخدام الأجسام المضادة الدقيقة نفسها التي استخدمت في الدراسات التي نشرت دون أن يؤكد التوافق. الأجسام المضادة لاختيار الأمثل ، ينبغي للمرء أن ينظر في مستوى التعبير عن بروتين يتم فحصها. بصفة عامة ، ينبغي استخدام ما هو متاح من ألمع ملون تألقي الأضداد الموسومة صمة عار على السطح علامات وأعرب خافت ، بينما يمكن استخدام fluorochromes قاتمة للتلوين علامات سطح أعرب للغاية (8). بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة في مثل هذه الطريقة التي تتداخل بين الأطياف انبعاثاتها هو الحد الأدنى. لتلطيخ متعدد الألوان ، فإنه من الصعب للغاية في اختيار ملون تألقي التي لا تتداخل الطيفية. في هذه الحالة ، يتم تنفيذ التعويض.

التعويضات اللازمة للقضاء على التداخل رياضيا مضان بين الطيف انبعاثات fluorochromes المختلفة التي يتم قياسها بواسطة أجهزة الكشف عن (8-10). وبعبارة أخرى ، هو مطروح التداخل مضان من ملون تألقي من طيف ملون تألقي انبعاثات أخرى. احتساب التعويض يتطلب مراقبة غير ملوثين والضوابط الإيجابية واحد لكل ملون تألقي تستخدم لتلوين متعدد الألوان (9 ، 10). ويمكن إجراء التعويض باستخدام الخلايا أو الخرز. حبات سهلة وصمة عار ، وإشارة قوية وتوفر طريقة سهلة لإعداد ضوابط الملون واحد التي لديها fluorophores نفس العينات التجريبية. الخرز التعويض هي مفيدة بشكل خاص عندما يتم التعبير عن بروتين سطح الخلية من الفائدة عند مستوى منخفض ، وعندما السكان خلية من الفائدة يحد من السكان الأولي خلية البداية.

مرة واحدة وقد تم اختيار الأضداد ، ينبغي أن يكون الأمثل نشاطهم عن طريق إجراء تحليل المعايرة. وهذا أمر مهم لا سيما إذا كان الجهاز قد FACS يزر قوية للغاية. ويمكن استخدام تركيزات أدنى من الأضداد في تلطيخ نتيجة الفصل الفقيرة من السكان الخلية المطلوبة من مجموع السكان الخلية. استخدام تركيزات عالية جسم يزيد من فرصة لتلطيخ غير محددة مستضد. ولذلك سوف يسمح للمعايرة الأضداد اختيار تركيز الأجسام المضادة التي تعطي أقصى سطوع للسكان والحد الأدنى من تلطيخ إيجابية خلفية (8).

FACS الآن تقنية موحدة لتنقية مجموعات سكانية فرعية من الخلايا. يمكن استخدامه لفصل أي نوع من الخلايا التي يمكن أن تتولد تعليق خلية واحدة والأجسام المضادة المتوفرة لتحديد السكان الخلية المطلوبة. FACS هو الأسلوب المفضل عند حighly مطلوبة السكان الخلية نقية.