Demostramos el protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de células somáticas humanas con lentivirus mediada por la entrega de los factores humanos Oct4, Sox2, Nanog, y Lin28. Pluripotencia fue confirmada por la morfología y la presencia de células madre embrionarias (ES) de células específicas de los marcadores.
En 2006, Yamanaka y sus colegas demostraron por primera vez que retrovirus mediada por la entrega y la expresión de Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 es capaz de inducir el estado pluripotente en fibroblastos de ratón. 1 El mismo grupo también informó de la reprogramación exitosa de las células somáticas humanas en madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando células versiones humanas de los mismos factores de transcripción entregada por vectores retrovirales. 2 Por otra parte, James Thomson et al. informaron que el lentivirus mediada por la co-expresión de otra serie de factores (Oct4, Sox2, y Nanog Lin28 ) fue capaz de reprogramar las células somáticas humanas en células iPS. 3
Las células iPS son similares a las células madre embrionarias en la morfología, la proliferación y la capacidad de diferenciarse en todos los tipos de tejidos del cuerpo. Células iPS humanas tienen una clara ventaja sobre células madre embrionarias, ya que muestran las características clave de células madre embrionarias sin el dilema ético de la destrucción de embriones. La generación de pacientes específicos de las células iPS evita un obstáculo importante para las terapias personalizadas medicina regenerativa mediante la eliminación de la posibilidad de rechazo inmunológico no autólogo las células trasplantadas.
Aquí se demuestra el protocolo para la reprogramación de células de fibroblastos humanos con el Stemgent Set Humanos Lentivirus TF. También muestran que las células reprogramadas con este conjunto comienza a mostrar iPS morfología cuatro días después de transducción. Utilizando el Stemolecule Y27632, que hemos seleccionado para las células iPS y la morfología correcta observado después de tres rondas secuenciales de la colonia de la cosecha y pasajes. También demuestran que después de reprogramar las células muestran la pluripotencia marcador de AP, los marcadores de superficie TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, y SSEA-3, y marcadores nucleares Oct4, Sox2 y Nanog.
Estos resultados demuestran que la Stemgent Set Humanos Lentivirus TF puede ser utilizado para generar de manera eficiente las colonias de iPS mediante la inducción de la expresión ectópica de transducidas factores de transcripción en fibroblastos humanos. En el diseño de experimentos de reprogramación, las variables se deben considerar varias para optimizar la eficiencia de la reprogramación. En primer lugar, la participación activa de virus al objetivo ratio (multiplicidad de infección MOI) puede ser necesario modificar durante el paso de la transducción de primaria para lograr la eficiencia de transducción óptima. En segundo lugar, las condiciones de crecimiento de las células diana pueden afectar la reprogramación. Las células sanas y proliferantes son más susceptibles a la reprogramación. En tercer lugar, al modificar el protocolo para el número de células diferentes, se recomienda que los números de las células diana se ajustará proporcionalmente a la superficie de la placa de cultivo. Por último, la aplicación de inhibidores de rock como Y27632 deben ser considerados para ayudar a asegurar la reprogramación exitosa ya que estudios recientes han demostrado su utilidad en la mejora de la supervivencia de la colonia hES 4,5.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Human TF Lentivirus Set | Stemgent | 00-0005 | ||
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | ||
TRA-1-81 antibody | Stemgent | 09-0012 | ||
TRA-1-60 antibody | Stemgent | 09-0009 | ||
SSEA-4 antibody | Stemgent | 09-0003 | ||
SSEA-3 antibody | Stemgent | 09-0014 |