Desde James Thomson et al desarrollaron una técnica en 1998 para aislar y hacer crecer hES en cultivo, las células de congelación para su uso posterior y el deshielo y la ampliación de las células de un stock congelado se han convertido en importantes procedimientos realizados en el cultivo de rutina hES celular. Dado que las células hES son muy sensibles a las tensiones de la congelación y descongelación, debe tomar especial cuidado. Aquí se demuestra la técnica adecuada para descongelar rápidamente las células hES de las reservas de nitrógeno líquido, revestimiento de las células de ratón en el alimentador de embriones, y poco a poco de congelación para almacenamiento a largo plazo.
Desde James Thomson<em> Et al</em> Desarrollado una técnica en 1998 para aislar y hacer crecer hES en la cultura, congelar células para su uso posterior y el deshielo y la ampliación de las células de una masa congelada se han convertido en importantes procedimientos realizados en el cultivo de rutina hES celular. Dado que las células hES son muy sensibles a las tensiones de la congelación y descongelación, debe tomar especial cuidado. Aquí se demuestra la técnica adecuada para descongelar rápidamente las células hES de las reservas de nitrógeno líquido, revestimiento de las células de ratón en el alimentador de embriones, y poco a poco de congelación para almacenamiento a largo plazo.
El video que acompaña muestra un método para la descongelación y la congelación de las células hES. Las células congeladas en nitrógeno líquido debe ser descongelado baño tan pronto como sea posible para obtener la mejor recuperación posible. Recuerde que debe tener mucho cuidado al pipetear células deshielo: minimizar la manipulación de las células y la pipeta suavemente. Un vial de células hES puede ser chapada en cualquiera de los dos pocillos de una placa de 6 pocillos, o todos los pocillos de una placa de 4 bien y colocarse inmediatamente en la incubadora. Desde el cultivo en cuatro pozos separados reduce la posibilidad de perder toda la cultura a la contaminación, y hace más fácil para localizar colonias hES celda en la superficie más pequeña, la placa de 4 y se recomienda descongelar las células hES por primera vez.
El primer día después de la descongelación las células hES, las colonias son pequeñas y pueden ser transparentes. Reponer las células hES medio de cultivo todos los días, aunque las colonias no son visibles bajo el microscopio, ya que puede tardar algunos días en la cultura de las células hES para aparecer como las colonias establecidas. Es importante utilizar una capa MEF alimentador recién plateado descongelar las células, como las colonias a menudo no llegan a un tamaño apropiado para los pases hasta el 10 de 12 días después de la descongelación.
Cuando se descongela un vial paso bajo de células HES, es una buena práctica para ampliar y la congelación de los viales adicionales para mantener un stock de células de paso bajo para futuros cultivos y experimentos. También es una buena idea de congelar sistemáticamente todos los "extra" las células sanas hES de mantenimiento de existencias congeladas. El deshielo de más éxito y de las culturas posteriores han sido bloqueados por alta calidad, diferenciado, de forma activa división de las colonias de células hES. células hES recuperarse de una congelación de manera más eficiente si se maneja con cuidado, como los agregados de células grandes. El tamaño total final debe ser similar a (o ligeramente más grande que) el tamaño de los agregados plateado después de un viaje de rutina.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
DMSO | Sigma | D2560 | For freezing medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipettes | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Cryogenic vials | Nunc | 5000-1020 | 1.5 mL capacity | |
Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | “Mr. Frosty” |