ويتجلى بروتوكول للكشف عن trichothecenes (السموم الفطرية للقلق على الصحة البشرية) باستخدام أسلوب الفحص وضعت حديثا على أساس أسلوب immunochemical تنافسية وكشف الكهروكيميائية النهائي.
المناعية هي بديل صالح للاستهلاك كمية HPLC أكثر كلفة والوقت أو GC 1 ، 2 طرق للكشف فحص السموم الفطرية الخطرة في السلع الغذائية. في هذا البروتوكول نظهر كيفية تلفيق واستجواب انزيم الكهروكيميائية تنافسية مقايسة immunomagnetic مرتبط على أساس استخدام الخرز المغناطيسي ودعما قويا لسلسلة immunochemical 3 و أقطاب الشاشة المطبوعة والاستشعار عن منصة.
لدينا وسيلة تهدف إلى تحديد المبلغ الإجمالي للHT – 2 و T – 2 السموم ، والسموم الفطرية تعود لعائلة trichothecenes وقلق كبير على صحة الإنسان 4. استخدام الأجسام المضادة لاستنساخ عبر التفاعل مع 100 ٪ من نحو 2 و HT – 2 – T يسمح للكشف عن السموم في وقت واحد على حد سواء مع حساسية مماثلة 5.
الخطوة الأولى للمقايسة لدينا هي الخطوة طلاء أين نحن شل HT2 – KLH السم المتقارن على السطح من الخرز المغناطيسي. بعد خطوة الحجب ، من الضروري تجنب الجواذب غير محددة ، وإضافة ريتوكسيماب يسمح المنافسة بين يجمد HT – 2 و HT – 2 مجانا أو T – 2 موجودة في العينة أو الذائب في محلول قياسي.
في نهاية هذه الخطوة من حيث المنافسة ، وكمية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ترتبط يجمد HT – 2 سوف تكون متناسبة عكسيا مع كمية من السم في حل العينة.
وتستخدم الأجسام المضادة الثانوية المسمى مع الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب) للكشف عن الربط بين الأجسام المضادة المحددة ويجمد HT – 2. يتم تنفيذ الخطوة النهائية قياس ألقت عليه قسامة التعليق حبة المغناطيسي ، والمقابلة لحل محدد / نموذج قياسي ، على سطح القطب الشاشة المطبوعة في العمل ، ويتم يجمد الخرز المغناطيسي ومركزة عن طريق المغناطيس وضعت على وجه التحديد في إطار الشاشة المطبوعة الكهربائي. بعد دقيقتين من الحضانة بين حبات المغناطيسي وركيزة لأب ، يتم الكشف عن المنتج الأنزيمية التي Voltammetry نبض التفاضلية (DPV) باستخدام أداة محمولة (PalmSens) قادرة أيضا على بدء تلقائيا eight قياسات ضمن فاصل زمني من بضع ثوان.
وقد شهد استخدام الأجسام المضادة وتحقيق الاعتراف الجزيئية البيولوجية استخدام تقنيات الاستشعار عن بعد على نطاق واسع ل؛ منهجيات الكشف immunochemical ، مثل ELISAs وMEIAs ، هي ، في الوقت الحاضر ، من بين المنصات المستخدمة وتطبيقها في العديد من المختبرات 7.
<p class="jove_content" style=";text-…والكتاب أود أن أشكر نانسي داونر وجميع أعضاء من مختبر الكيمياء التحليلية من جامعة روما "تور فيرغاتا" للتعاون والدعم اللوجستي. وأيد هذا العمل من قبل "BioCop" مشروع الاتحاد الأوروبي.
Reagents
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Sigma | P9791 | |
Disodium hydrogen phosphate | Sigma | S3264 | |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
MgCl2 anhydrous | Sigma | M8266 | |
DEA (99.5%) | Sigma | 31589 | |
HCl 37% | Sigma | 320331 | |
H3BO3 | Sigma | B6768 | |
Tris[hydroxymethyl]-aminomethane | Sigma | 252859 | |
BSA (albumin bovine serum) | Sigma | A4503 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
TWEEN 20 | Sigma | P9416 | |
NaN3 | Aldrich | 71290 | |
1-Naphthyl phosphate disodium salt | Fluka | N7255 | |
Skimmed milk blocking solution – non fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), stock solution (1 mg/ml in PBS): | Biopure | 004050 | The HT-2-KLH conjugate was obtained by CDI-method where the free OH-groups on position 3 and 4 at the HT-2 toxin were activated by N,N’-carbonyldiimidazole (CDI) and the activated HT-2 toxin was let to react with aminogroups of the protein (KLH) to generate a stable carbammate linkage. |
Secondary labeled antibody: Anti-mouse IgG (H+L) from horse, conjugated with Alkaline Phosphatase, concentration 1 mg/ml. | Vector Laboratories | AP-2000 | |
HT-2 toxin | Biopure | ||
Magnetic beads: Dynabeads® | Dynal | M-280 Tosylactivated | Concentration 2 x 109 beads/ml. |
Solutions
Name of the reagent | Preparation | Comments (optional) |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Dissolve 0.20 g of potassium chloride, 0.20 g of potassium dihydrogen phosphate, 1.16 g of disodium hydrogen phosphate and 8.00 g of sodium chloride in 900 ml of water | |
Diethanolamine buffer, DEA, 0.97 M + 1 mM MgCl2 + 0.15 M KCl, pH 9.8 | Dissolve 0.0476g of MgCl2 anhydrous and 7.3.59 g of KCl in ~ 300 ml of water. After dissolution add 51 ml of DEA (99.5%). Adjust pH to 9.8 with HCl (6 M). Dilute to 500 ml with water. | |
Borate buffer, 0.1 M, pH 9.5 | Dissolve 3.09 g of H3BO3 in ~ 300 ml of distilled water; adjust pH to 9.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 500 ml with distilled water. | |
TRIS buffer, 0.2 M, pH 8.5 | Dissolve 3.85 g of Tris[hydroxymethyl]-aminomethane in 100 ml of water. Adjust to pH 8.5 with NaOH and/or HCl (6 M or lower concentrations). Dilute to 200 ml with water. | |
TRIS buffer + BSA solution (0.1%), pH 8.4 | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of TRIS buffer pH 8.4. | This solution must be freshly prepared on the day of use. |
PBS buffer + TWEEN® 0.05% | Dissolve 0.250 g of TWEEN 20 in 500 ml of the previously prepared PBS buffer, pH 7.4 | |
PBS buffer + BSA solution 0.1% | Dissolve 0.050 g of BSA in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. | This solution must be freshly prepared on the day of use. |
PBS buffer + BSA 0.1% + NaN3 0.02% | Dissolve 0.050 g of BSA and 0.010 of NaN3 in 50 ml of PBS buffer, pH 7.3. | Storage solution |
Enzymatic substrate | Dissolve 0.010 g of 1-Naphthyl phosphate sodium salt in 100 ml of DEA buffer pH 9.8. Wrap the flask tightly in aluminium foil. | This solution must be freshly prepared on the day of use. |
Skimmed milk blocking solution | Add 0.20 g of Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) to 200 ml of PBS buffer pH 7.3. | This solution must be freshly prepared on the day of use. |
HT-2 stock solution | Dissolve 10 mg of trichothecene HT-2 toxin vial, in 10 ml of acetonitrile to give a solution with a concentration of 1 mg/ml. |
Split up this solution into single-use aliquots of 30 ml and store them at less than -30 °C. |
HT-2 Working standard solution | Pipette 20 ml of HT-2 toxin stock solution into a 2 ml calibrated volumetric flask and dilute with acetonitrile to obtain a HT-2 working solution containing 10 μg /ml of trichothecene toxin. | This solution should be freshly prepared on the day of use. |
HT-2 Working calibrant solutions | Dilute the HT-2 working standard solution (10 μg/ml) to prepare working calibrant solution 100 ng/ml. Dilute HT-2 working calibrant solution 100 ng/ml to prepare working calibrant solutions of the following concentrations 0 (blank), 0.5, 1, 2, 4, 10 ng/ml. | These solutions must be prepared fresh on the day of use. |
HT-2 conjugated with KLH | Split up HT-2 conjugated with KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) stock solution (1 mg/ml in PBS) into single-use aliquots of 350 μl. | Store aliquots at -30 °C. |
Specific Monoclonal Antibody | Dilute 1:350 (v:v) the stock concentration (1.383 mg/ml) of monoclonal antibody in PBS to use in competition step | This solution must be prepared fresh at the moment of use. 10 ml antibody stock solution in PBS for a final volume of 3.5 ml, are enough to analyze 17 standards and /or samples. |
Secondary Labeled Antibody | Anti-mouse IgG (H+L) conjugated with Alkaline Phosphatase is diluted 1:100 (v:v) in PBS to use in competition step. | 100 μl antibody stock solution in PBS for a final volume of 10 ml, are enough to analyze 25 standards and /or samples. This solution must be prepared fresh at the moment of use. |
Apparatus
Name of the reagent | Company | Comments (optional) |
Magnetic Particle Concentrator: MPC®-S | Dynal | |
PalmSens instrument | PalmSens | Provided with PalmSens Lite, Serial cable connecting PC laptop and Mux options software |
CH8 PalmSens Multiplexer | PalmSens | |
Eight channel Mux electric contact | hand made | |
Strip with eight screen printed electrodes (SPEs) | hand made | |
Specially designed support for electrodes strip | hand made | Includes 8 neodymium magnets each of which is placed below each working electrode surface of the SPE |
Calibrated microliter pipettes | Gilson | |
Magnetic stirrer and stir bars. | ||
Glass beakers (100, 50, 20 ml). | ||
Volumetric flasks (2ml). | ||
0.2 and 2ml Eppendorf tubes. | Eppendorf | |
Falcon™ tubes of 5ml and 15ml. | Falcon | |
Laboratory Vortex Mixer | Do not use vortex mixer to resuspend magnetic beads coated with HT2-KLH or linked with immunological chain to avoid denaturing of proteic parts | |
Laboratory oven or thermostated room | Choose a oven able to keep a temperature of 37±3 °C. |