Un protocollo per rilevare tricoteceni (micotossine di preoccupazione per la salute umana), utilizzando un metodo di screening di nuova concezione basata su un metodo competitivo immunochimici e una rilevazione finale elettrochimica è dimostrata.
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Articolo metodologico
ELIME (Enzyme Linked Immuno magnetica elettrochimici) metodo di rilevazione micotossine
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunologici sono una valida alternativa al più costoso e richiede tempo quantitativa HPLC o GC 1, 2 metodi di screening per la rilevazione di micotossine pericolose nei prodotti alimentari. In questo protocollo si mostra come fabbricare e interrogare un enzima competitivo elettrochimica alla prova di immunomagnetica basato sull'uso di sfere magnetiche come supporto solido per la catena di immunochimica 3 e elettrodi serigrafati come piattaforma di rilevamento.
Il nostro metodo mira a determinare la quantità totale di HT-2 e tossine T-2, micotossine appartenente alla famiglia tricoteceni e di grande preoccupazione per la salute umana 4. L'uso di un clone di anticorpo con una reattività incrociata del 100% verso HT-2 e T-2 consente di rilevare simultaneamente sia le tossine con sensibilità simili 5.
Il primo passo della nostra analisi è la fase di rivestimento in cui si immobilizzare HT2-KLH tossina coniugato sulla superficie di sfere magnetiche. Dopo una fase di blocco, necessario per evitare assorbimenti non specifici, l'aggiunta di un anticorpo monoclonale permette la competizione tra immobilizzato HT-2 e liberi presenti HT-2 o T-2 nel campione o disciolte in una soluzione standard.
Al termine della fase di concorso, la quantità di anticorpo monoclonale legato alla immobilizzato HT-2 sarà inversamente proporzionale alla quantità di tossina nella soluzione campione.
Un anticorpo secondario marcato con fosfatasi alcalina (AP) è usato per rivelare il legame tra l'anticorpo specifico e la immobilizzato HT-2. Il passo finale di misurazione viene eseguita lasciando cadere una aliquota di sospensione magnetica tallone, corrispondente ad uno specifico campione / soluzione standard, sulla superficie di uno schermo-stampa dell'elettrodo di lavoro; sfere magnetiche sono immobilizzati e concentrato per mezzo di un magnete posizionato proprio sotto l' serigrafato elettrodo. Dopo due minuti di incubazione tra sfere magnetiche e un substrato per AP, il prodotto enzimatico viene rilevato da Voltammetria Differential Pulse (DPV) utilizzando uno strumento portatile (PalmSens) anche in grado di avviare automaticamente otto misure in un intervallo di pochi secondi.
Protocollo
1) Il blocco rivestito sfere magnetiche:
Procedere come segue per bloccare patinata sfere magnetiche:
- Preparare una serie di tubi Eppendorf da 2 ml;
- Omogeneizzare (agitazione, ma non vortex) rivestito sfere magnetiche (si veda l'appendice per la preparazione di carta patinata sfere magnetiche) con il campione di rotazione mixer;
- Immediatamente dopo omogeneizzazione, pipettare 10 ml di rivestimento sfere magnetiche in ogni tubi separati Eppendorf;
- Aggiungere 1 ml di latte scremato blocco soluzione in ciascuna provetta Eppendorf del set;
- Lasciate sfere magnetiche incubare per 30 minuti a t....
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Discussione
L'uso di anticorpi come sonde biomolecolari riconoscimento ha visto un ampio utilizzo di tecnologie di rilevamento, metodologie di rilevazione immunochimica, quali ELISA e MEIAs, sono, al giorno d'oggi, tra le piattaforme più utilizzate e applicate in molti laboratori 7.
Anche se questi approcci raggiungere una sensibilità eccezionale e specificità, un obiettivo primario di molti gruppi di ricerca negli ultimi anni è stato il miglioramento e l'ottimizzazione delle loro.......
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Ringraziamenti
Autori desiderano ringraziare Nancy Downer e tutti i membri del laboratorio di Chimica Analitica, Università di Roma "Tor Vergata" per la loro collaborazione e supporto logistico. Questo lavoro è stato supportato dal progetto UE "Biocop".
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Materiali
Reagenti
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Cloruro di potassio | Sigma | P9333 | |
| Potassio fosfato monobasico | Sigma | P9791 | |
| Idrogeno fosfato disodico | Sigma | S3264 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | S3014 | |
| MgCl2 anidro | Sigma | M8266 | |
| DEA (99,5%) | Sigma | 31589 | |
| HCl 37% | Sigma | 320331 | |
| H 3 BO 3 | Sigma | B6768 | |
| Tris [idrossimetil]-amminometano | Sigma | 252859 | |
| BSA (albumina sierica bovina) | Sigma | A4503 | |
| NaOH | Sigma | S5881 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| NaN 3 | Aldrich | 71290 | |
| 1-naftil fosfato sale disodico | Fluka | N7255 | |
| Soluzione di latte scremato in blocco - non grassa del latte secco | Bio-Rad | 170-6404 | |
| HT-2 coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella), soluzione madre (1 mg / ml in PBS): | Biopure | 004050 | L'HT-2-KLH coniugato è stato ottenuto da CDI-metodo in cui sono stati attivati i gruppi-OH libero in posizione 3 e 4 alla tossina HT-2 da N, N'-carbonyldiimidazole (CDI) e l'attivazione HT-2 tossina è stata lasciare a reagire con aminogroups della proteina (KLH) per generare un legame stabile carbammati. |
| Secondaria anticorpo marcato: Anti-mouse IgG (H + L) dal cavallo, coniugato con fosfatasi alcalina, concentrazione 1 mg / ml. | Laboratori Vector | AP-2000 | |
| HT-2 tossina | Biopure | ||
| Biglie magnetiche: Dynabeads ® | Dynal | M-280 Tosylactivated | Concentrazione di 2 x 10 9 sfere / ml. |
Soluzioni
| Nome del reagente | Preparazione | Commenti (opzionale) |
| Tampone fosfato (PBS), pH 7,4 | Sciogliere 0,20 g di cloruro di potassio, 0,20 g di potassio fosfato monobasico, 1,16 g di fosfato acido disodico e 8,00 g di cloruro di sodio in 900 ml di acqua | |
| Dietanolammina buffer, DEA, 0,97 M + 1 mM MgCl 2 + 0,15 M di KCl, pH 9,8 | Sciogliere 0.0476g di MgCl2 anidro e 7.3.59 g di KCl in ~ 300 ml di acqua. A dissoluzione avvenuta aggiungere 51 ml di DEA (99,5%). Regolare il pH a 9,8 con HCl (6 M). Diluire a 500 ml con acqua. | |
| Borato tampone, 0,1 M, pH 9,5 | Sciogliere 3,09 g di H 3 BO 3 a ~ 300 ml di acqua distillata, aggiustare il pH a 9,5 con NaOH e / o HCl (6 M o concentrazioni più basse). Diluire a 500 ml con acqua distillata. | |
| TRIS buffer, 0,2 M, pH 8,5 | Sciogliere 3,85 g di Tris [idrossimetil]-amminometano in 100 ml di acqua. Aggiustare il pH 8.5 con NaOH e / o HCl (6 M o concentrazioni più basse). Diluire a 200 ml con acqua. | |
| TRIS tampone + soluzione di BSA (0,1%), pH 8,4 | Sciogliere 0,050 g di BSA in 50 ml di tampone TRIS pH 8.4. | Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. |
| PBS + 0,05% Tween ® | Sciogliere 0,250 g di Tween 20 in 500 ml del preparato in precedenza tampone PBS, pH 7,4 | |
| PBS + BSA soluzione 0,1% | Sciogliere 0,050 g di BSA in 50 ml di tampone PBS, pH 7.3. | Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. |
| PBS + BSA 0,1% + 0.02% NaN3 | Sciogliere 0,050 g di BSA e 0,010 di NaN 3 in 50 ml di tampone PBS, pH 7.3. | Stoccaggio soldistribuzione pesi |
| Substrato enzimatico | Sciogliere 0,010 g di sale 1-naftil fosfato di sodio in 100 ml di pH tampone DEA 9.8. Avvolgere il pallone strettamente in un foglio di alluminio. | Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. |
| Soluzione di latte scremato in blocco | Aggiungere 0,20 g di Blotting grado Blocker non-Fat Milk secco (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a 200 ml di tampone PBS pH 7.3. | Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. |
| HT-2 Soluzione | Sciogliere 10 mg di tricoteceni HT-2 fiala tossina, in 10 ml di acetonitrile per dare una soluzione con una concentrazione di 1 mg / ml. | Diviso questa soluzione in un solo usare aliquote di 30 ml e conservarli a meno di -30 ° C. |
| HT-2 Soluzione standard | Pipettare 20 ml di HT-2 soluzione di tossina magazzino in un ml 2 calibrato pallone tarato e diluire con acetonitrile per ottenere un HT-2 soluzione di lavoro contenente 10 mg / ml di tossina tricoteceni. | Questa soluzione deve essere preparata il giorno di utilizzo. |
| HT-2 soluzioni calibrante di lavoro | Diluire il HT-2 soluzione standard di lavoro (10 mg / ml) per preparare la soluzione di lavoro calibrante 100 ng / ml. Diluire HT-2 soluzione di lavoro calibrante 100 ng / ml per preparare soluzioni di lavoro calibrante delle seguenti concentrazioni 0 (bianco), 0,5, 1, 2, 4, 10 ng / ml. | Queste soluzioni devono essere preparato fresco il giorno di utilizzo. |
| HT-2 coniugato con KLH | Suddivisi HT-2 coniugato con KLH (Keyhole Hemocyanin Patella) soluzione madre (1 mg / ml in PBS) in monouso aliquote di 350 microlitri. | Aliquote conservare a -30 ° C. |
| Anticorpo monoclonale specifico | Diluire 1:350 (v: v) la concentrazione stock (1,383 mg / ml) di anticorpo monoclonale in PBS da utilizzare in fase concorrenza | Questa soluzione va preparata di fresco al momento dell'uso. 10 ml di soluzione di anticorpi magazzino in PBS per un volume finale di 3,5 ml, sono sufficienti per analizzare 17 norme e / o campioni. |
| Secondaria anticorpo marcato | Anti-topo IgG (H + L) coniugato con fosfatasi alcalina è diluito 1:100 (v: v) in PBS da utilizzare in fase concorrenza. | 100 ul soluzione madre di anticorpi in PBS per un volume finale di 10 ml, sono sufficienti per analizzare 25 norme e / o campioni. Questa soluzione va preparata di fresco al momento dell'uso. |
Apparato
| Nome del reagente | Azienda | Commenti (opzionale) |
| Particelle magnetiche concentratore: MPC ®-S | Dynal | |
| PalmSens strumento | PalmSens | Dotato di PalmSens Lite, seriale PC portatile cavo di collegamento e software Mux opzioni |
| CH8 PalmSens Multiplexer | PalmSens | |
| Otto canali Mux contatto elettrico | fatti a mano | |
| Striscia con otto elettrodi serigrafati (SPE) | fatti a mano | |
| Supporto appositamente progettato per nastro elettrodi | fatti a mano | Comprende 8 magneti al neodimio ciascuno dei quali è posto al di sotto di ogni superficie dell'elettrodo di lavoro della SPE |
| Pipette calibrate microlitro | Gilson | |
| Agitatore magnetico e bar mescolare. | ||
| Bicchieri di vetro (100, 50, 20 ml). | ||
| Matracci tarati (2 ml). | ||
| 0,2 e 2 ml Eppendorf tubi. | Eppendorf | |
| Provette Falcon ™ di 5 ml e 15 ml. | Falco | |
| Laboratorio di Vortex Mixer | Non usare vortex per risospendere le sfere magnetiche rivestite con HT2-KLH o legati con catena immunologica ad evitare denaturazione proteica delle parti | |
| Laboratorio forno o camera termostatati | Scegli un forno in grado di mantenere una temperatura di 37 ± 3 ° C. |
Riferimenti
- Koch, P. State of the art of trichothecenes analysis. Toxicol. Letters. 153, 109-112 (2004).
- Krska, R., Baumgartner, S., Josephs, R. State of the art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals. Fresenius J. Anal. Chem. 371
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Ristampe e permessi
