Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen
Summary
Dit protocol beschrijft de afleiding van transplanteerbare hematopoietische stamcellen uit muis embryonale stamcellen (ESC) en de daaropvolgende injectie in dodelijk bestraalde ontvangende muizen. In het kort, worden ESC gedifferentieerd embryoid lichamen, die vervolgens besmet zijn met retrovirale HoxB4 en co-gekweekt met OP9 stromale cellen en hematopoietische cytokines.
Abstract
Een stamcel is gedefinieerd als een cel met de capaciteit om zowel de zelf-vernieuwing en het genereren van meerdere gedifferentieerde nageslacht. Embryonale stamcellen (ESC) zijn afgeleid van de blastocyst van de vroege embryo en zijn pluripotent in differentiative vermogen. Hun ruime differentiative potentieel heeft hen de focus van veel onderzoek gericht op het afleiden hoe ze te coax te klinisch bruikbare soorten cellen te genereren. De succesvolle afleiding van hematopoietische stamcellen (HSC) van muis ESC is onlangs bereikt en kunnen worden gevisualiseerd in deze video protocol. HSC, misschien wel de klinisch meest uitgebuite cel populatie, worden gebruikt om een groot aantal hematopoietische maligniteiten en aandoeningen te behandelen. Echter, veel patiënten die baat kan hebben bij HSC therapie geen toegang tot geschikte donoren. ESC zou kunnen bieden een alternatieve bron van HSC voor deze patiënten. Het volgende protocol voorziet in een basislijn vanwaar ESC-HSC kan worden bestudeerd en op de hoogte inspanningen om HSC isoleren van menselijke ESC. In dit protocol worden ESC gedifferentieerd embryoid instanties (EBS) voor 6 dagen in de handel verkrijgbare serum vooraf gescreend voor een optimale hematopoietische differentiatie. EBS worden vervolgens gescheiden en geïnfecteerd met retrovirale HoxB4. Geïnfecteerde EB-afgeleide cellen worden uitgeplaat op OP9 stroma, een beenmerg stromale cellijn afgeleid van de Calvaria van M-CSF-/ – muizen, en co-gekweekt in de aanwezigheid van hematopoiese het bevorderen van cytokines voor tien dagen. Tijdens deze co-cultuur, de geïnfecteerde cellen sterk uit te breiden, wat resulteert in de generatie van een heterogene pool van 100s van miljoenen cellen. Deze cellen kunnen vervolgens worden gebruikt om de reddings-en reconstitueren dodelijk bestraalde muizen.
Protocol
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice | Animal | Taconic Farm | ||
| Plate shaker | Tool | VWR | 33998-360 | Orbital Shaker by Ikaworks |
| Multi-channel pipettor | Tool | VWR | 15000-174 | ePet by BioHit |
| ES trypsin | Reagent | Invitrogen | 15090-046 | 0.25% Trypsin in PBS |
| Standard trypsin | Reagent | Invtrogen | 25300-062 | 0.05% Trypsin-EDTA |
| PBS | Buffer | Invitrogen | 20012-027 | |
| Enzyme-free dissociation buffer | Buffer | Invitrogen | 13151-014 | |
| Dissociation enzyme mix | Buffer | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg Collagenase IV |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H2126 | freeze in 500 uL aliquots and avoid repeated freezing and thawing. |
| DNAse | Reagent | Sigma | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Protamine sulfate | Reagent | Sigma | P3369 | 8 ug/mL |
| EB differentiation media | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 10% IMDM+cytokines | medium | Please view recipe on attached Protocol.doc | ||
| 20% anti-MEM | Please view recipe on attached Protocol.doc |
