Инженерно Cell-проницаемой белка

Summary

Белки трансдукции позволяет прямой доставки биологически активных белков в клетки. В отличие от традиционных методов, таких как трансфекции ДНК или вирусной трансдукции этой неинвазивной парадигма позволяет высокоэффективных сотовых манипуляции в титруемой образом в обход сотового токсичность и риск онкогенных преобразование постоянного генетической модификации.

Abstract

Техника белков трансдукции позволяет прямой доставки биологически активных веществ в клетках млекопитающих [см. обзор ^1,2]. Для этого можно использовать translocating способность так называемого ячейки проникающих пептидов (ППС), также обозначается как белка трансдукции доменов (PTDs). TAT-CPP происходит от иммунодефицита человека вирусом типа 1 (ВИЧ-1) Tat (транс-активатор транскрипции) белок широко используется. Положительно заряженные ТАТ способствует клеточной проницаемости тем самым преодолевая барьеры клеточной мембраны путем эндоцитоза и / или прямое проникновение мембраны ^2. В сочетании с сигнал ядерной локализации (NLS) слитые белки способны проникать ядра выставке функциональность. Наши видео-презентацию демонстрирует, как иллюстрация для инженерных клеточных белков проницаемой, строительства, производства и применения клеточных проницаемой версию ДНК-модифицирующие фермент Cre.

Cre является конкретным участкам рекомбиназы, который может распознавать и рекомбинировать 34 база сайтов пара loxP в клетках млекопитающих в пробирке и в естественных условиях. Поэтому Cre / loxP система широко используется для условного вызывать мутации в геноме живых клеток ^3,4. Доставки активных Cre рекомбиназы к клеткам, однако, представляет собой ограничение.

Мы описываем системы pSESAME вектор, который позволяет прямое включение гена интересов, и предоставляет платформу для быстрого клона разных доменах и тегов, используемых в вектор в удобной и стандартизованным образом. Реорганизация различных тегов, как было показано изменение биохимических свойств белков слияния предоставление возможности для достижения более высокой урожайности и лучшей растворимости. Мы демонстрируем, как можно выразить и очистить рекомбинантных клеточных белков в проникающий и от кишечной палочки. Функциональность рекомбинантный белок Cre, наконец, утверждены в культуре клеток, оценивая его внутриклеточной активности рекомбиназы.

Protocol

Строительство вектор экспрессии и выражения: PSESAME-Cre вектор экспрессии была построена вставка Cre-кодирования фрагмента в pSESAME через AvrII и NheI сайты рестрикции с использованием стандартных методов клонирования. pSESAME кодирует белок слияния, состоящий из гистидина-теги, ТАТ-область, NLS последовательности и Cre, сокращенно HTNCre. Для выражения HTNCre pSESAME-Cre было преобразовано в TUNER (DE3) pLacI и используется для подготовки глицерина акций. В течение ночи культуру засевают использованием пипетки наконечник покрытием с преобразованным бактерий из глицерина акций. В течение ночи культуры состояла из LB среде с 0,5% глюкозы [об. /] и карбенициллин в конечной концентрации 50 мкг / мл и было позволено расти при температуре 37 ° С в течение 16 часов. На следующий день густо выросли на ночь культуры используют для инокуляции выражение культуры в соотношении 1 к 40 и был помещен в инкубатор при 37 ° C. Выражение культуры состояла из ТБ среде с 0,5% глюкозы [об. /] и ампициллин в конечной концентрации 100 мкг / мл. В OD 595 из 1,5 выражение культуры вызывали с 0,5 мМ IPTG в течение 1 ч. Впоследствии бактерий были собраны путем центрифугирования при 5000 оборотах в минуту в течение 10 минут в SLA3000 ротора. Бактерии гранулы хранились при температуре минус 20 ° С до очистки. Очистка ячейки проницаемой белка: Замороженные гранулы бактерии ресуспендировали в 10 мл лизирующего буфера на литр культуры колбу в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем суспензию инкубировали с 1 мг / мл лизоцима еще на 15 минут при перемешивании при комнатной температуре. 25 Ед / мл benzonase был добавлен позже и инкубировали при перемешивании в течение 15 минут при комнатной температуре. После озвучивания на льду в течение 1,5 мин с 0,5 импульсов с при 45% мощности, 1 мл холодного буфера соль винной (БСЭ) в мл суспензии осторожно добавляют при перемешивании и выдерживают в течение 5 мин на льду. SDS-PAGE образец лизат фракции (L) принято не было. Очищенные лизат получали центрифугированием при 4 ° С в течение 30 мин при 30000 g. SDS-PAGE образцов растворимого (S) и нерастворимых фракций (I) были приняты. Супернатант переносили в 50 мл свежего труб сокола и был затем осторожно перемешивают в течение 1 ч при 4 ° С с 2 мл 50% Ni-NTA шлама на литр первичной культуры выражения. Суспензию упакованы в самотеком EconoPac колонке (SDS-PAGE образец проточного фракции (FT) была сделана) и дважды промывают 5 постельное объемов моющий буфер. SDS-PAGE образцах как мытье фракций (W1 и W2) были собраны. HTNCre-содержащие фракции элюировали 3 постельное объемами буфера элюирования и образца элюата фракции (Е) для SDS-PAGE анализа был взят. Имидазола удаляли диализа элюирования фракция против высоких буфера соли в два раза. Раствора белка еще более концентрируется диализа против буфера глицерина в два раза. Во всех диализных шаги отношение буфер для образца, по крайней мере 50. Эта процедура привела к решению глицерина семенного материала, HTNCre в обычной концентрации от 200 до 450 мкм, то есть 1 литр выражение культуры приведет к ~ 12 мг белка. Пример глицерина акций (GS) для SDS-PAGE анализа была собрана. HTNCre маточный раствор можно хранить при температуре минус 20 ° С. Рисунок 1: SDS-PAGE анализа проб, взятых при очистке Cre рекомбиназы. Индукция выражение Cre указывается доминирующей группой в лизат фракции. Хотя часть белка нерастворимые белки Cre может быть обогащен как видно из элюата и фракции глицерина акций. L: лизат, я: Не растворяется, S: Супернатант, FT: проточные, Вт: стиральная, E: элюата, Г. С.: Gylcerol бирже. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1. Белки трансдукции в мышиных эмбриональных стволовых (ЭС) клеток: ES клеток, несущих условной β-галактозидазы репортер 5 построить высевают как отдельные клетки, используя TrypLE ™ Express для диссоциации прилипшие клетки. После 4-х до 6 часов клетки было повторное подключение и среду удаляли. Впоследствии ЭС клетки инкубировали с HTNCre среде, содержащей в течение 16 часов. Соответствующее количество белка HTNCre (соответствует 10 мкМ) из глицерина акции разбавляли в среду ES, а затем стерильной фильтрации (0,22 мкм). После среду белков трансдукции был изменен обратно в нормальный средний рост. После двух дней клетки промывали PBS и фиксировали 4% Параформальдегид (PFA) в течение 10 минут. Два дополнительныхных этапов промывки с PBS были казнены до X-Gal окрашивание проводилось. Фиксированные клетки были покрыты слоем X-Gal красящим раствором 6 и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C. Представитель Результаты: На следующий день X-Gal окрашивание раствора стремилась и клетки были покрыты слоем PBS для микроскопии анализа. От 80 до 100% от рекомбинированное клетки можно было наблюдать в мышиных клетках ES судить по β-галактозидазы.

Discussion

Во время процесса очистки слитый белок Cre важно не пропустить добавлением льда буфера холодной TBS перед центрифугированием. В противном случае Cre рекомбиназы имеет тенденцию осаждаться внутри глицерина буфера.

Если элюата фракция появляется, чтобы стать мутной из-за высокой концентрации гибридный белок дополнительного буфера элюирования следует добавить, пока раствор не прояснилось снова.

Применение 10 мкмоль белка слияния Cre обычно приводит к рекомбинации эффективность от 80 до 100%. Эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) является одной из основных компонент среднего ячейки ES сильно подавляет белок трансдукции. Поэтому высокая концентрация Cre рекомбиназы должны были быть использованы. При работе в бессывороточной условиях меньше белка (0,5 – 2 мкм) может быть использован для достижения аналогичных эффективность рекомбинации.

С системой pSESAME вектор в стороны, можно применить технику белков трансдукции к другим белкам, включая транскрипционные факторы, такие как Oct4 и Sox2 ⁷ и Scl/Tal1 ^8.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
TUNER (DE3) pLacI		Novagen	70625
Glycerol		Carl Roth	3783.2
Na2HPO4		Roth	T876.1
Trizma Base		Sigma-Aldrich	T1503
HCl		Roth	4625.1
Imidazol		Roth	X998.4
NaCl		Roth	9265.2
Yeast Extract		Roth	2363.4
Trypton/Pepton		Roth	8952.4
K2HPO4		Roth	P749.2
KH2PO4		Roth	3904.1
Ampicillin		Sigma	A9518
Carbenicillin		Sigma	6344.2
HEPES		Sigma	H3375
Lysozyme		Sigma	62971
Benzonase		Novagen
L-Tartaric acid, disodium salt		Sigma
50% Ni-NTA slurry		Invitrogen	R901-15
EconoPac columns		Biorad	732-1010
Sterile filter 0,22μm		Whatman
Paraformaldehyde (PFA)		Sigma
LB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, NaCl
TB medium				Yeast extract, Trypton/Pepton, Glycerol, K2HPO4, KH2PO4
Lysis Buffer				50 mM Na2HPO4, 5 mM Tris, pH 7.8
Tartaric Salt Buffer (TSB)				PTB containing 2 M L-Tartaric acid, disodium salt, and 20 mM Imidazol
Washing Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol
Elution Buffer				PTB, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol
High Salt Buffer				600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
Gylcerol Buffer				50% glycerol, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4
TrypLE™ Express		Invitrogen
ESGRO (LIF)		Millipore
NEAA		Gibco	11140035
L-Glutamin		Gibco	25030024
β-Mercaptoethanol		Gibco	31350010
DMEM		Gibco	11960044
PBS		Gibco
Fetal Calf Serum (FCS)		PAA
X-Gal staining solution:				4 mM K3(FeIII(CN)6), 4 mM K4(FeII(CN)6), 2mM MgCl2 0.4 mg/mL X-Gal solved in PBS
K3(FeIII(CN)6)		Sigma	P-3367
K4 (FeII(CN)6)		Sigma	P-9387
MgCl2		Sigma	M8266
X-Gal		Sigma	B4252