Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt
Summary
Bu protokol, boyalar, ayarlanabilir bir çözünürlüğe sahip, sağlam sinir ağları gibi kobay enterik sinir sistemi plexuses gibi optik kayıt sağlayan elektriksel aktivitenin ne kadar voltaj duyarlı göstermektedir ki, tek hücrelerden çok ganglion devre arasında değişmektedir.
Abstract
Enterik sinir sistemi (ENS) izolasyon karmaşık davranışları gerçekleştirme yeteneğine tespit fonksiyonları ile kendi kendine yeten bir ağdır. Onun nöron (çapı 10-25 mikron), bağırsak duvarı farklı düzlemler ile sınırlı plexuses düzenlenmiştir<sup> 1</sup>; Myenterik pleksus uzunlamasına ve sirküler kas tabakaları ve sirküler kas tabakası ve mukoza arasında submüköz pleksus arasında bulunabilir. Bu plexuses efektör sistemleri bu yana (epitel taşıma, endokrin hücreleri, bağışıklık elemanları, kan damarları ve düz kas) aynı zamanda bağırsak duvarının içinde yer alan, yarı sağlam hazırlıkları çeşitli refleks yollar bireysel bileşenleri korumak disseke edilebilir. Efektör sistemlerin davranış, uyum içinde hareket eden submüköz ve myenterik pleksuslar tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, ganglionlar içinde ve arasında, ve pleksuslar arasındaki iletişimi sinaptik etkileşimlerinin ayrıntılı bilgi, normal gastrointestinal fonksiyon anlamak için esastır. ENS, sağlam bir sinir sistemi gibi, moleküler ve hücresel olayların bir nöronal ağ elektrik davranış ve fizyolojik çıkışları ile ilişkili olan eşsiz bir deneysel model. Çünkü onun plexuses yarı-iki-boyutlu bir organizasyon, ENS özellikle de voltaj duyarlı boyalar istihdam birden fazla site optik kayıt teknikleri kullanılarak yapay sinir ağları çalışma için uygundur<sup> 2,7,8,9</sup>. Biz burada nispeten yeni bir naphthylstyryl-piridinium boya (di-4-ANEPPDHQ) kullanımını göstermek<sup> 3</sup> Önceki modellerine göre çok düşük bir fototoksisite yavaş hızı, içselleştirme ve olağanüstü kimyasal kararlılık dahil olmak üzere birden çok avantajlar sunmaktadır. Alt milisaniye çözünürlüğü izin veren bir kamera ile birlikte kullanıldığında, bu boya bize 100X büyütmede ~ 2.5 mm maksimal uzaysal çözünürlüğü ile görüş alanı içindeki tüm nöronların elektriksel aktivitenin izlemenize olanak sağlar. Düşük büyütme (10X veya 20X), tek hücreli çözünürlük kurban arası ganglion devresi inceliklerini ifşa, perspektif içinde bir kazanç ile telafi edilir.
Protocol
Discussion
Bu protokol, iki gol düşünülerek yazılmıştır. Bunlardan birincisi, son on yılda pek çok teknolojik gelişmeler, voltaj duyarlı boyalar kullanılarak elektriksel aktivite optik kayıt sayesinde sağlam nöron ağları eğitim için en güçlü, güvenilir ve uygun fiyatlı yöntemler biri haline gelmiştir ki, diğer araştırmacılar ikna etmeye; gerçekten kolayca mütevazı kaynaklara sahip bir laboratuvarda bile uygulanan olabilir. Ikinci golü, moleküler ve hücresel olayların iki nöronal plexuses ve b…
Acknowledgements
DA Coulter (CHOP) Biz bize, bize onun teknik uzmanlık paylaşımı için 2-foton videonun başında gösterilen resimler ve H. Takano elde etmek için 2-foton mikroskop kullanmak izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Medium 199 | Sigma, St. Louis, MO | M3769 | With Earle’s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate | |
| Sylgard | Dow Corning Corp., Midland, MI | 184 silicone elastomer kit | ||
| Insect pins used for dissection | F.S.T., Foster City, CA | 26001-30 | ||
| Dumont forceps | F.S.T., Foster City, CA | 11203-23 or 11200-33 | ||
| Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors | F.S.T., Foster City, CA | 15371-92 | ||
| Pins to hold the tissue during the experiment | Seirin Corp., Shizuoka, Japan | Seirin Spinex | ||
| Collagenase VII | Sigma, St. Louis, MO | C0773 | ||
| Protease IX | Sigma, St. Louis, MO | P6141 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Carlsbad, CA | 10439-016 | ||
| PenStrep | GIBCO, BRL | 15140 | ||
| L-Glutamine 100X | GIBCO, BRL | 25030 | ||
| Nifedipine | Sigma, St. Louis, MO | |||
| Di-4-ANEPPDHQ | Molecular Probes, Eugene, OR | D36802 | ||
| 4-Channel Stimulus Generator | Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany | 2000 Series | ||
| Peristaltic pump | Rainin, Woburn, MA | 2-channel Dinamax RP-1 | ||
| High-speed camera | RedShirtImaging, LLC Decatur, GA | NeuroCCD-SM | ||
| 1:10 demagnifier / relay lens | Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY | |||
| Upright microscope | Olympus Optical Co., Tokyo, Japan | BX61TRF | ||
| Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator | Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada | PSSG–BX2 | ||
| Linear matrix electrodes | FHC, Inc., Bowdoin, ME | Custom made | ||
| Active vibration-isolation table | Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA | Micro 60 | ||
| Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply | Kepco, Flushing, NY | ATE 75-15M | ||
| Heat filter | Schott Optical Glass, Duryea, PA | KG-1 | ||
| High-Q interference filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ530/50 | ||
| Dichroic mirror | Chroma, Inc., Rockingham, VT | 565 nm (50% transmission) | ||
| Long-pass filter | Chroma, Inc., Rockingham, VT | HQ572LP | ||
| Acoustic curtains | Acoustical Surfaces, Inc. | BSC-25 | ||
| Neuroplex | RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA | |||
| IDL | ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO | |||
| High-resolution CCD camera, with its own camera controller | Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan | |||
| Frame-grabber for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | DT3120K-1 | ||
| Imaging software for high-resolution camera | Data Translation, Marlboro, MA | Global Lab Image/2 |
Riferimenti
- Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. . in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).
- Obaid, A. L. Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus. J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).
- Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis. J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).
- Hirst, G. D., McKirdy, H. C. Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine. J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).
- Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. Current Methods in Cellular Neurobiology. , 139-139 (1983).
- Salzberg, B. M. An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology. Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).
- Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system. J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).
- Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum. Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).
- Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system. Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).
