Summary

Генетические исследования белков человека Ремонт ДНК Использование дрожжей в качестве модельной системы

Published: March 18, 2010
doi:

Summary

Генетические исследования у дрожжей могут быть использованы для исследования молекулярных и клеточных функций генов человека в клеточный метаболизм ДНК. Описаны методы генетической характеристике человека<em> WRN</em> Продукт гена дефекты преждевременного старения расстройства синдром Вернера в функционально сохраняется пути использования дрожжей, как послушный модели системы.

Abstract

Понимание роли человеческих белков репарации ДНК в генетических путей является сложной задачей для многих исследователей. Генетические исследования млекопитающих системы были ограничены из-за отсутствия доступных инструментов, включая генетический мутант определены клеточных линий, систем регулирования выражения, а также соответствующие выбор маркеров. Чтобы обойти эти трудности, модель генетических систем в низших эукариот стали привлекательным выбором для изучения функционально сохраняется репарации ДНК белков и путей. Мы разработали модель системы дрожжей учиться плохо определенными генетическими функциями синдром Вернера геликазы-нуклеазы (<em> WRN</em>) В метаболизма нуклеиновых кислот. Сотовая фенотипов связано с определенными генетическими мутант фоны могут быть исследованы, чтобы прояснить клеточные и молекулярные функции<em> WRN</em> Через свою каталитическую деятельность и белковых взаимодействий. Человека<em> WRN</em> Гена и связанные с ними варианты, клонированы в ДНК плазмид для экспрессии в дрожжах, могут быть помещены под контроль нормативных плазмиды элемента. Выражение конструкция может быть преобразована в соответствующую дрожжей мутант фон, и генетическая функция анализировали с помощью различных методик. Используя этот подход, мы определили, что<em> WRN</em>, Как и связанные с ним семью RecQ членов BLM и Sgs1, работает в топ3-зависимого пути, которая может иметь важное значение для стабильности генома. Это описано в нашей недавней публикации [1] в<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Подробные методы специфической анализы для генетических исследований дополнения в дрожжах приведены в этой статье.

Protocol

1. Штаммов дрожжей Штаммы с диким типом SGS1 TOP3 (WT; W303-1A, генотип, ВСУ ade2-1 CANL-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRPL-л URA3-1) [2], sgs1 мутант (W1292-3C ; генотип MAT SUP4-о:: URA3 sgs1-25 ade2-1 can1-100 his3-11, 15 leu2-3, 112 TRP1-1 URA3-1 rad5-535) и sgs1 топ3 мутант (W1058-11C, генотип, ВСУ SUP4-о:: URA3 sgs1-25 топ3-2:: H…

Discussion

Одной из сильных сторон использования дрожжей в качестве модельной системы является наличие мутантов в определенных репликации ДНК и ремонт путей, которые сохраняются между дрожжей и людей. Дальнейший отбор трансформантов укрывательство определенных генов просто и надежно, как лабо…

Acknowledgements

Эта работа была поддержана в полном объеме Внутренние программы исследований NIH, Национальный институт по проблемам старения. Мы благодарим д-р Родни Ротштейн (Колумбийский университет) для штаммов дрожжей и доктор Брэд Джонсон (Университет Пенсильвании, Школа медицины, Филадельфия, штат Пенсильвания) для выражения SGS1 плазмиды.

Riferimenti

  1. Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
  2. Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
  3. Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 162, 647-662 (2002).
  4. Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
  5. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
  6. von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
check_url/it/1639?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Aggarwal, M., Brosh Jr., R. M. Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System . J. Vis. Exp. (37), e1639, doi:10.3791/1639 (2010).

View Video