Studi genetici di proteine umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello
Summary
Gli studi genetici nel lievito può essere impiegato per studiare le funzioni cellulari e molecolari dei geni umani nel metabolismo del DNA cellulare. I metodi sono descritti per la caratterizzazione genetica della persona umana<em> WRN</em> Prodotto del gene difettoso nella sindrome di invecchiamento precoce disordine Werner nel funzionalmente percorsi conservate usando lievito come sistema modello trattabili.
Abstract
Comprendere il ruolo delle proteine di riparazione del DNA umano nei percorsi genetica è una sfida formidabile per molti ricercatori. Studi genetici nei sistemi di mammiferi sono stati limitati a causa della mancanza di strumenti facilmente reperibili anche definito le linee di cellule mutanti genetici, sistemi di espressione normativi e appropriati marcatori selezionabili. Per aggirare queste difficoltà, sistemi modello genetico in eucarioti inferiori sono diventati una scelta interessante per lo studio delle proteine DNA funzionalmente conservato riparazione e percorsi. Abbiamo sviluppato un sistema di lievito modello per studiare le funzioni mal definiti genetici della sindrome di Werner elicasi-nucleasi (<em> WRN</em>) Nel metabolismo degli acidi nucleici. Fenotipi cellulari associati definito background genetico mutante può essere indagato per chiarire le funzioni cellulari e molecolari<em> WRN</em> Attraverso le sue attività catalitica e le interazioni delle proteine. L'essere umano<em> WRN</emGene> e varianti associate, clonati in plasmidi per l'espressione del DNA nel lievito, può essere posto sotto il controllo di un elemento normativo plasmide. Il costrutto di espressione può essere trasformata in secondo piano lievito appropriato mutante, e la funzione genetica analizzati da una varietà di metodologie. Usando questo approccio, abbiamo determinato che<em> WRN</em>, Come la sua famiglia relativi RecQ membri BLM e Sgs1, opera in un Top3-dipendente percorso che rischia di essere importante per la stabilità genomica. Questo è descritto nel nostro recente pubblicazione [1] a<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Dettagliata dei metodi di analisi specifici per gli studi genetici di complementazione in lievito vengono forniti in questo articolo.
Protocol
Discussion
Uno dei punti di forza di usare lievito come sistema modello è la disponibilità di mutanti nella replicazione del DNA definiti e meccanismi di riparazione che si conservano tra il lievito e gli esseri umani. Ulteriore selezione dei trasformanti ospitare i geni specifici è facile e affidabile come i ceppi mutanti di laboratorio sono auxotrophic e vettori con marcatori auxotrophic sono facilmente disponibili. L'utilizzo di questi vettori l'espressione di prodotti genici possono essere regolati ponendoli sotto i…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in pieno dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute on Aging. Ringraziamo il Dott. Rodney Rothstein (Columbia University) per i ceppi di lievito e il Dr. Brad Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania) per l'espressione SGS1 plasmide.
Riferimenti
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
