Estudos genéticos de proteínas de reparo do DNA Humano Utilizando Levedura como um sistema modelo
Summary
Estudos de genética em leveduras podem ser empregadas para investigar as funções de celular e molecular dos genes humanos no metabolismo do DNA celular. Métodos são descritos para a caracterização genética do ser humano<em> WRN</em> Produto do gene defeituoso na desordem envelhecimento precoce na síndrome de Werner funcionalmente as vias conservadas usando leveduras como um sistema modelo tratável.
Abstract
Compreender o papel das proteínas de reparo de DNA humano em vias de genética é um grande desafio para muitos pesquisadores. Estudos genéticos em sistemas de mamíferos têm sido limitados devido à falta de ferramentas disponíveis, incluindo linhas de células mutantes definido genético, sistemas de expressão regulamentar, e apropriado marcadores selecionáveis. Para contornar essas dificuldades, os sistemas de modelo genético em eucariotos inferiores tornaram-se uma opção atraente para o estudo de proteínas funcionalmente DNA conservado reparação e caminhos. Nós desenvolvemos um sistema de levedura modelo para estudar as funções mal definidas genética da síndrome de Werner helicase-nuclease (<em> WRN</em>) No metabolismo do ácido nucléico. Fenótipos celulares associados com genética definida backgrounds mutante pode ser investigadas para esclarecer as funções celulares e moleculares da<em> WRN</em> Através de suas atividades catalíticas e interações proteína. O ser humano<em> WRN</em> Gene e as variantes associadas, clonados em plasmídeos de DNA para expressão em levedura, pode ser colocado sob o controle de um elemento regulador plasmídeo. A construção de expressão pode então ser transformado em fundo de levedura apropriadas mutante, ea função genética analisada por uma variedade de metodologias. Usando essa abordagem, que determinou que<em> WRN</em>, Como sua família relacionadas RecQ membros BLM e Sgs1, opera em um caminho Top3-dependente que é provável que seja importante para a estabilidade genômica. Isto é descrito em nossa publicação recente [1] em<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Métodos detalhados de ensaios específicos para estudos de complementação genética em leveduras são fornecidas neste papel.
Protocol
Discussion
Um dos pontos fortes da utilização de leveduras como um sistema modelo é a disponibilidade de mutantes na replicação do DNA definido e vias de reparação que são conservados entre leveduras e humanos. Uma outra seleção de transformantes abrigar os genes específicos é fácil e confiável como as cepas de laboratório são mutantes auxotróficos e vetores com marcadores auxotróficos estão prontamente disponíveis. Usando esses vetores a expressão de produtos de genes pode ser regulada, colocando-os sob o con…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado integralmente pelo programa de Pesquisa Intramural do, NIH National Institute on Aging. Agradecemos ao Dr. Rodney Rothstein (Columbia University) para as cepas de leveduras e Brad Dr. Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, na Filadélfia, Pensilvânia) para a expressão SGS1 plasmídeo.
Riferimenti
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
