Los estudios genéticos de proteínas humanas de reparación del ADN utilizando la levadura como un sistema modelo
Summary
Los estudios genéticos de la levadura puede ser empleado para investigar las funciones celulares y moleculares de los genes humanos en el metabolismo del ADN celular. Se describen los métodos para la caracterización genética de los humanos<em> WRN</em> Producto del gen defectuoso en el síndrome de envejecimiento prematuro Werner trastorno funcional en las vías de conservación con la levadura como un sistema modelo manejable.
Abstract
Comprender las funciones de las proteínas de reparación del ADN humano en vías genéticas es un gran desafío para muchos investigadores. Los estudios genéticos en sistemas de mamíferos han sido limitados debido a la falta de herramientas fácilmente disponibles, incluyendo define las líneas de células mutantes genéticos, sistemas de regulación de expresión, y marcadores de selección adecuados. Para sortear estas dificultades, los sistemas de modelo genético en eucariotas inferiores se han convertido en una opción atractiva para el estudio de proteínas funcionalmente conservados de reparación del ADN y las vías. Hemos desarrollado un sistema de levadura modelo para estudiar las funciones mal definidas genética del síndrome de Werner helicasa-nucleasa (<em> WRN</em>) En el metabolismo de los ácidos nucleicos. Fenotipos celulares asociados con la definida mutantes antecedentes genéticos pueden ser investigados para aclarar las funciones celulares y moleculares de<em> WRN</em> A través de sus actividades catalizadoras e interacciones de las proteínas. El ser humano<em> WRN</emGen> y las variantes asociadas, clonado en plásmidos de ADN para la expresión en la levadura, se puede colocar bajo el control de un elemento de regulación del plásmido. La construcción de expresión puede ser transformado en el fondo de levadura mutante apropiado, y la función de cultivares ensayados por una variedad de metodologías. Con este enfoque, se determinó que<em> WRN</em>, Al igual que su relación RecQ miembros de la familia y la BLM Sgs1, opera en una vía Top3-dependiente que es probable que sea importante para la estabilidad genómica. Esto se describe en la publicación reciente [1] en<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Métodos detallados de los ensayos específicos para los estudios de complementación genética en la levadura se proporcionan en este documento.
Protocol
Discussion
Una de las ventajas de la utilización de la levadura como un sistema modelo es la disponibilidad de los mutantes en la replicación del ADN definida y las vías de reparación que se conservan entre la levadura y los humanos. Mayor selección de transformantes albergar los genes específicos es fácil y fiable como las cepas de laboratorio son mutantes autotróficas y vectores con marcadores auxotróficos están fácilmente disponibles. El uso de estos vectores de la expresión de los productos de los genes puede ser r…
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en su totalidad por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Agradecemos al Dr. Rodney Rothstein (Columbia University) para las cepas de levadura y el Dr. Brad Johnson (Universidad de Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania) para la expresión SGS1 plásmido.
Riferimenti
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
