Genetiska studier av människans proteiner DNA Repair använder jäst som modellsystem
Summary
Genetiska studier i jäst kan användas för att undersöka de molekylära och cellulära funktioner av mänskliga gener i cellens DNA metabolism. Metoder beskrivs för genetisk karaktärisering av det mänskliga<em> WRN</em> Genprodukten defekt i tidigt åldrande sjukdom Werner syndrom i funktionellt bevarade vägar med hjälp av jäst som en lätthanterlig modellsystem.
Abstract
Förstå roller humana proteiner DNA-reparation i genetiska vägar är en oerhörd utmaning för många forskare. Genetiska studier i däggdjur system har varit begränsad på grund av avsaknaden av lättillgängliga verktyg som definieras mutant genetiska cellinjer, regelsystem uttryck, och lämpliga valbara markörer. För att kringgå dessa svårigheter har modell genetiska system i lägre eukaryoter bli ett attraktivt val för att studera funktionellt bevarade proteiner DNA-reparation och vägar. Vi har utvecklat ett system för modell jäst för att studera dåligt definierade genetiska funktioner Werner syndrom helikas-nukleas (<em> WRN</em>) I nukleinsyrametabolismen. Cellular fenotyper samband med definierade genetisk mutant bakgrunder kan undersökas för att klargöra de cellulära och molekylära funktioner<em> WRN</em> Genom sin katalytiska aktiviteter och interaktioner protein. Den mänskliga<em> WRN</em> Gen och tillhörande varianter, klonade i DNA plasmider för uttryck i jäst, kan placeras under kontroll av en reglerande plasmid element. Uttrycket bygga kan sedan omvandlas till lämpligt jäst mutant bakgrund och genetisk funktion bestäms genom en rad olika metoder. Med denna metod bestäms vi att<em> WRN</em>, Liksom dess relaterade RecQ familjemedlemmar BLM och Sgs1, verkar i en Top3-beroende väg som sannolikt kommer att vara viktigt för genomisk stabilitet. Detta beskrivs i vår senaste publikation [1] vid<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Detaljerade metoder för specifika analyser för genetiska komplettering studier i jäst finns i detta dokument.
Protocol
Discussion
En av styrkorna med att använda jäst som modellsystem är tillgången på mutanter i definierade DNA-replikation och vägar reparation som bevaras mellan jäst och människa. Ytterligare urval av transformants hysa de specifika gener är enkelt och tillförlitligt eftersom laboratoriestammar är auxotrophic mutanter och vektorer med auxotrophic markörer är lätt tillgängliga. Med hjälp av dessa vektorer uttrycket av genen produkter kan regleras genom att placera dem under kontroll av en inducerbara promotor (t.ex….
Acknowledgements
Detta arbete stöddes fullt ut av den Interna Forskningsprogram NIH, National Institute on Aging. Vi tackar Dr Rodney Rothstein (Columbia University) för jäststammar och Dr Brad Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia) för SGS1 uttryck plasmiden.
Riferimenti
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
