Dissection en direct de Drosophile Embryons: méthodes simplifiées pour le dépistage de collections de mutants par immunofluorescence
Summary
Nous décrivons un protocole simplifié pour générer des «filets» des préparations d'embryons de drosophile de génotypes spécifiques. Ce protocole permet l'exécution efficace d'une variété d'écrans génétique. Il permet également une excellente visualisation des structures dans l'embryon en retard.
Abstract
Embryons de drosophile entre les étapes 14 et 17 du développement embryonnaire peut être facilement découpé à générer "filet" préparations. Dans ces préparations, le système nerveux central descend au milieu, et est flanqué par les parois du corps. Beaucoup de phénotypes différents ont été examinés à l'aide de ces préparations. Dans la plupart des cas, les filets ont été générés par la dissection des anticorps fixés teinté toute monture embryons. Ces «dissections fixes" ont quelques inconvénients, cependant. Ils sont longs à exécuter, et il est difficile de trier mutant (GFP-négatif) des embryons à partir des stocks dans lequel les mutations sont maintenues sur les chromosomes d'équilibrage GFP. Depuis 2002, notre groupe a effectué des carences et des écrans expression ectopique d'identifier des ligands pour les récepteurs orphelins. Pour ce faire, nous avons développé des protocoles rationalisé pour la dissection embryon vivant et coloration des anticorps de collections contenant des centaines de lignes équilibrées. Nous avons conclu qu'il est beaucoup plus efficace d'examiner les phénotypes dans les grandes collections des stocks par dissection vivre que par dissection fixe. En utilisant le protocole décrit ici, un seul individu formé peut filtrer jusqu'à 10 lignes par jour pour les phénotypes, en examinant 4-7 embryons mutants de chaque ligne sous un microscope composé. Cela permet l'identification de mutations conférant subtile, faible pénétrance phénotypes, puisque jusqu'à 70 hemisegments par ligne sont notés à fort grossissement 40X avec une immersion dans l'eau de l'objectif.
Protocol
Discussion
Nous espérons que cette vidéo de démonstration a affiché nos méthodes pour la dissection embryon vivant et coloration avec suffisamment de détails qu'ils peuvent maintenant être facilement exécutées par toute personne qui a une certaine expérience de la drosophile génétique et en embryologie. Bien sûr, la pratique considérable sera toujours nécessaire, surtout pour les dissections eux-mêmes. Dans notre expérience, toute personne qui apprend les méthodes de dissection direct va créer un pr…
Acknowledgements
Nous remercions Nicki Fox et Aloisia Schmid pour leur contribution au développement de ces protocoles. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH RO1 au KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
Riferimenti
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
