Живая Препарирование Drosophila Эмбрионы: Упрощенная методы скрининга Мутант Коллекции антител Окрашивание
Summary
Мы описываем обтекаемый протокол для создания "филе" препараты эмбрионов дрозофилы конкретных генотипов. Этот протокол позволяет эффективного выполнения различных генетических экранов. Она также позволяет отличную визуализацию структур в конце эмбриона.
Abstract
Дрозофилы эмбрионов между этапами 14 и 17 эмбрионального развития может быть легко расчлененный для создания "филе" препаратов. В этих препаратов, центральная нервная система работает по середине, и в окружении теле стены. Многие различные фенотипы были изучены с помощью таких препаратов. В большинстве случаев, филе были получены путем рассечения антител окрашенных фиксированных целом монтажа эмбрионов. Эти «фиксированные вскрытия" есть некоторые недостатки. Они отнимают много времени для выполнения, а это трудно разобраться мутант (GFP-отрицательный) эмбрионы от акций, в которых мутации хромосом сохраняется в течение GFP балансировки. С 2002 года наша группа ведет дефицит и внематочной экраны выражение для идентификации лигандов для детей-сирот рецепторов. Для того, чтобы сделать это, мы разработали обтекаемый протоколов для живых рассечение эмбриона и антител окрашивание коллекций, содержащих сотни симметричные линии. Мы пришли к выводу, что это значительно более эффективным для изучения фенотипов в больших коллекций запасы живой рассечение, чем фиксированной рассечение. Использование протокола, описанные здесь, один обученный человек может экрана до 10 строк в день в течение фенотипы, рассматривая 4-7 мутантных эмбрионов из каждой строки под соединение микроскопа. Это позволяет идентифицировать мутации присвоении тонкие, низко-фенотипы пенетрантностью, так как до 70 hemisegments в строке засчитываются при большом увеличении с 40X воды погружения линз.
Protocol
Discussion
Мы надеемся, что это видео демонстрация показала наши методы для живых рассечение эмбриона и окрашивания достаточно подробно, что теперь они могут быть легко выполнен любым лицом, которое имеет некоторый опыт дрозофилы генетики и эмбриологии. Конечно, значительную практику все е?…
Acknowledgements
Мы благодарим Ники Фокс и Алоизия Шмид за их вклад в развитие этих протоколов. Эта работа была поддержана NIH RO1 предоставить KZ, NS28182.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Borosilicate Tubing With Filament | Sutter Instrument | BF120-60-10 | ||
| Narishige model PC-10 needle puller | Narishige | Tubes pulled using a heater level of 58.9 |
Riferimenti
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Desai, C. J., Gindhart, J. G., Goldstein, L. S., Zinn, K. Receptor tyrosine phosphatases are required for motor axon guidance in the Drosophila embryo. Cell. 84, 599-609 (1996).
- Sun, Q., Schindelholz, B., Knirr, M., Schmid, A., Zinn, K. Complex genetic interactions among four receptor tyrosine phosphatases regulate axon guidance in Drosophila. Molecular and cellular neurosciences. 17, 274-291 (2001).
- Schmid, A., Schindelholz, B., Zinn, K. Combinatorial RNAi: a method for evaluating the functions of gene families in Drosophila. Trends in neurosciences. 25, 71-74 (2002).
- Fox, A. N., Zinn, K. The heparan sulfate proteoglycan syndecan is an in vivo ligand for the Drosophila LAR receptor tyrosine phosphatase. Curr Biol. 15, 1701-1711 (2005).
