Automated Protocole microfluidiques lyse du sang pour l'enrichissement de cellules circulantes nucléées

Summary

Un dispositif automatisé microfluidique a été développé pour faire circuler l'enrichissement de cellules nucléées du sang périphérique via lyse des globules rouges qui assure l'isolement de l'échantillon de haute qualité sans perte de cellules.

Abstract

Dans ce rapport, le protocole d'un dispositif automatisé de sang microfluidique lyse est détaillée. Circulants des cellules nucléées (CNC), y compris les leucocytes et les cellules endothéliales, de fournir une plateforme idéale pour une mise à jour le statut de la condition immunitaire d'un individu. Le protocole permet microfluidique pour l'enrichissement de CNC, sans perte de cellules sélectives et de la variabilité due à la préparation d'échantillons par l'utilisateur médiation étapes. Brièvement, le protocole comprend la fabrication de dispositifs, de la collecte de l'échantillon, configuration de l'appareil, et courir le sang dans la chambre microfluidique. Dans le dispositif de sang total est rapidement mélangé avec de l'eau déminéralisée pendant environ 10 secondes dans un canal de 50 microns x 150 microns microfluidique. En ce moment érythrocytes sont lysés durée en raison des conditions hypotoniques. Structures chevrons sur le fond du canal d'assurer un mélange complet et l'exposition des cellules à un environnement constant. Cellules restantes sont retournés aux conditions isotoniques à la sortie de l'appareil, fixe à l'aide de paraformaldéhyde à 2%, centrifugé pour séparer les débris érythrocytaires du CNC, et en suspension dans du tampon de flux pour la coloration et l'analyse par cytométrie en flux. Les résultats montrent propres parcelles de cytométrie en flux de dispersion avec les populations CNC sauvé. Signification de ce dispositif et le protocole vient à l'étude et la compréhension de la pathogenèse de la maladie par l'analyse des populations de CNC. Ainsi, l'automatisation, l'efficacité et la simplicité du protocole de microfluidique sont démontrés.

Protocol

Partie 1. Fabrication de dispositifs microfluidiques Un moule maître de silicium de l'appareil lyse microfluidique a été créé en utilisant des techniques de photolithographie avec l'équipement de l'Université de Louisville salle blanche [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc, San Rafael, Californie) a été utilisée pour générer un masque de transparence (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) pour créer des répliques négatives des canaux. L'appareil a été fabriqué lyse m…

Discussion

Un protocole de microfluidique automatisée lyse de sang n'a été rapporté. Dans le protocole sont des étapes importantes à noter. Dans la section P.2.1, il est important de jeter le flacon de sang recueillies pour la première que l'échantillon contient des cellules endothéliales matures délogé agissant comme de faux positifs. De plus, assurez-vous d'exécuter l'échantillon de sang dans l'heure de la collecte. Amorçage du dispositif microfluidique dans la section P.2.2, il est important de…

Materials