Misurazione delle proteine ​​plasmatiche Tariffe endocitico membrana da biotinilazione reversibile

Sommario

Endocitosi regolata regola i livelli di superficie cellulare espressione della maggior parte delle proteine ​​di membrana. Qui utilizziamo riducibili, reagenti biotinilazione impermeant membrana per misurare la velocità endocitico del trasportatore della dopamina (DAT), una proteina di membrana politopica. Il metodo favorisce un approccio diretto per misurare il tasso endocitico della maggior parte delle proteine ​​di membrana plasmatica.

Abstract

Proteine ​​di membrana plasmatica sono un grande gruppo eterogeneo di proteine ​​comprende recettori, canali ionici, trasportatori e pompe. Attività di queste proteine ​​è responsabile di una serie di eventi cellulari fondamentali, inclusa la consegna dei nutrienti, l'eccitabilità cellulare, e la segnalazione chimica. Molte proteine ​​di membrana plasmatica sono dinamicamente regolato da traffico endocitico, che modula la funzione delle proteine ​​di superficie, modificando l'espressione della proteina. I meccanismi che facilitano endocitosi di proteine ​​sono complesse e non sono pienamente compresi per molte proteine ​​di membrana. Al fine di comprendere appieno i meccanismi che controllano il traffico endocitico di una certa proteina, è fondamentale che il tasso di endocitico la proteina s essere misurato con precisione. Per molti recettori, misurazioni dirette tasso endocitico sono spesso raggiunto utilizzando ligandi dei recettori etichettati. Tuttavia, per molte classi di proteine ​​di membrana, come trasportatori, pompe e canali ionici, non c'è ligando conveniente che può essere utilizzato per misurare la velocità endocitico. Nella presente relazione, si descrive un metodo reversibile biotinilazione che impieghiamo per misurare il trasportatore della dopamina (DAT) tasso endocitico. Questo metodo fornisce un approccio diretto per misurare i tassi di interiorizzazione, e possono essere facilmente utilizzati per gli studi di traffico di proteine ​​di membrana più.

Protocollo

Panoramica della procedura:

Usando questo approccio, le proteine ​​della superficie cellulare sono covalentemente etichettati con biotina disponibili su residui di lisina extracellulare con un impermeant membrana, disolfuro ad accoppiamento reattivo biotinilazione (solfo-NHS-SS-biotina) con il traffico di condizioni restrittive (temperatura bassa) (vedi Fig. 1. per l'illustrazione). Un set di cellule è spostato al traffico di condizioni permissive (37 ° C) e le proteine ​​biotinilato interiorizzare. L'altra serie di cellule sono conservate a bassa temperatura come controlli per 1) la proteina superficie totale al tempo = 0, e 2) il controll....

Discussione

I problemi più comuni: Il problema più comune che si pone in questi esperimenti è l'efficienza striscia poveri. L'efficienza della striscia è fondamentale essere in grado di interpretare i risultati. A meno che la striscia è stata molto efficiente, non è possibile concludere che qualsiasi proteine ​​biotinilati nelle corsie internalizzazione erano, infatti, interiorizzati dalla superficie. Strisce di efficienza ≥ 90% sono ottimali, e noi scartare alcun risultato se la striscia scende al di sotto di questo.......