Mätning Plasma membranprotein Endocytic priser genom reversibel Biotinylation

Summary

Reglerad endocytos styr cellens nivåerna ytan uttryck för majoriteten av membranproteiner. Här använder vi reducera, membran impermeant biotinylation reagenser för att mäta endocytic hastighet av dopamin transportören (DAT), en polytopic membranprotein. Metoden möjliggör en okomplicerad metod för att mäta endocytic andelen flesta plasma membranproteiner.

Abstract

Plasma membranproteiner är ett stort och mångskiftande grupp av proteiner som består av receptorer, jonkanaler, transportörer och pumpar. Aktiviteten hos dessa proteiner är ansvarig för en rad viktiga cellulära händelser, bland annat näringstillförsel, cellulär retbarhet och kemiska signalering. Många plasma membranproteiner är dynamiskt regleras av endocytic människohandel, som modulerar proteiners funktion genom att förändra uttrycket protein yta. De mekanismer som underlättar protein endocytos är komplexa och inte helt klarlagda för många membranproteiner. För att till fullo förstå de mekanismer som styr endocytic handel med ett visst protein är det viktigt att proteinet är endocytic hastighet exakt mätas. För många receptorer, är direkta endocytic takt mätningar ofta uppnås utnyttja märkt receptor ligander. Men för många klasser av membranproteiner, exempelvis transportörer, pumpar och jonkanaler, det finns ingen praktisk ligand som kan användas för att mäta endocytic takt. I denna rapport beskriver vi en reversibel biotinylation metod som vi använder för att mäta dopamin transportören (DAT) endocytic kurs. Denna metod ger en enkel metod för att mäta internalisering priser, och kan lätt användas för handel studier av de flesta membranproteiner.

Protocol

Förfarande Översikt: Med hjälp av denna metod är cellytan proteiner kovalent märkt med biotin om tillgängliga extracellulära lysinrester med ett membran impermeant, disulfide-kopplad biotinylation reagens (sulfo-NHS-SS-biotin) under handel begränsande villkor (dvs låg temperatur) (se Figur 1. för illustration). En uppsättning av celler flyttas över till människohandel begränsande villkor (37 ° C) och biotinylerad proteiner internalisera. Den andra uppsättningen celler hålls vi…

Discussion

Vanliga problem: Det vanligaste problemet som uppstår i dessa experiment är dålig band effektivitet. Effektiviteten av remsan är avgörande i att kunna tolka resultaten. Om inte remsan var mycket effektiv, är det inte möjligt att dra slutsatsen att någon biotinylerad proteiner i internaliseringen körfält var i själva verket internaliserade från ytan. Strips ≥ 90% effektivitet är optimala och vi kasta några resultat om remsan sjunker under denna nivå. Ett exempel på ett dåligt band visas i figur …