Een praktische benadering van genetische Induceerbare Fate Mapping: een visuele gids voor Mark en Track Cellen In Vivo</em
Summary
Genetische Induceerbare Fate Mapping (GIFM) merken en tracks cellen met fijne ruimtelijke en temporele controle<em> In vivo</em> En belicht hoe de cellen van een specifieke genetische afstamming een bijdrage leveren aan het ontwikkelen en volwassen weefsels. Hier blijkt zijn de technieken die nodig zijn om het lot kaart E12.5 muis embryo's voor epifluorescerende en explantatie analyse.
Abstract
Fate kaarten worden gegenereerd door deze te markeren en het bijhouden van cellen in vivo te bepalen hoe voorouders bijdragen aan de specifieke structuren en celtypes in het ontwikkelen en volwassen weefsel. Een voorschot in dit concept is G enetic ik nducible F at M apping (GIFM), het koppelen van genexpressie, lot van de cel, en cel-gedrag in vivo, het lot kaarten gebaseerd op genetische afstamming te creëren.
GIFM exploits X-Creer lijnen waarbij X een gen of een reeks van gen-regulatorische elementen die de ruimtelijke expressie van een aangepaste bacteriofaag eiwit, Cre-recombinase (Creer T) verleent. Creer T bevat een aangepaste e Strogen r eceptor ligand bindend domein dat Creer T maakt afgezonderd in het cytoplasma in de afwezigheid van het geneesmiddel tamoxifen. De binding van tamoxifen releases Creer T, die naar de kern en bemiddelt recombinatie tussen DNA-sequenties geflankeerd door loxP sites. In GIFM, recombinatie treedt meestal op tussen een loxP geflankeerd Stop cassette voorafgaand aan een reporter-gen, zoals GFP.
Muizen zijn gefokt om ofwel een regio-of celtype-specifieke Creer en een voorwaardelijke verslaggever allel bevatten. Onbehandelde muizen hebben geen markering, omdat de Stop-cassette in de verslaggever voorkomt verdere transcriptie van het reportergen. Wij beheren tamoxifen door orale sondevoeding aan timed-drachtige vrouwtjes, die tijdelijke controle van Creer T release en de daarna translocatie naar de kern het verwijderen van de Stop cassette van de verslaggever biedt. Naar aanleiding van recombinatie, de verslaggever allel is constitutief en heritably uitgedrukt. Deze reeks van gebeurtenissen merken cellen zodanig dat hun genetische geschiedenis onuitwisbaar is vastgelegd. De gerecombineerde verslaggever dient dus als een high fidelity genetische afkomst tracer die, eenmaal op, is losgekoppeld van de genexpressie in eerste instantie gebruikt om Creer T rijden.
Wij passen GIFM in de muis om een normale ontwikkeling en vast te stellen de bijdrage van genetische lineages tot volwassen soorten cellen en weefsels te bestuderen. We gebruiken ook GIFM om cellen te volgen op de mutant genetische achtergronden om beter te begrijpen complexe fenotypen die opvallende kenmerken van de menselijke genetische aandoeningen na te bootsen.
Deze video artikel leidt onderzoekers door middel van experimentele methoden om met succes toe te passen GIFM. Tonen we de methode met behulp van onze goed gekarakteriseerde Wnt1-Creer T; mGFP muizen door het toedienen van tamoxifen bij embryonale dag (E) 8.5 via orale sondevoeding, gevolgd door ontleding bij E12.5 en analyse door epifluorescentie stereomicroscopie. We hebben ook laten zien hoe het lot in kaart gebracht domeinen micro-ontleden voor explantatie voorbereiding of FACS-analyse en ontleden volwassen lot-mapped hersenen voor de ganse berg fluorescerende beeldvorming. Tezamen zijn deze procedures kunnen de onderzoekers de kritische vragen in de ontwikkelingsbiologie en ziekte-modellen adres.
Protocol
Discussion
Het GIFM systeem dat we hebben laten zien kan worden gebruikt om een breed scala van vragen in een verscheidenheid van cellulaire processen te beantwoorden. Kan bijvoorbeeld muizen ontwikkeld met verschillende Cre drivers worden gebruikt om een celtype, weefsel of genetische afstamming van belang doel. Bovendien, omdat tamoxifen kan worden toegediend op elk gewenst embryonale of postnatale tijdstip, kan recombinatie worden gericht op alle relevante ontwikkelingsfase. De ruimtelijke en temporele controle van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar dat S. Arber voor de mGFP muizen en aan leden van de Zervas lab, die kritisch te lezen de krant en op voorwaarde dat technische bijstand. A. Brown werd ondersteund door een Brain Science Kaplan Summer Graduate Research Award. E. Normand werd ondersteund door een Brain Science Program Graduate Research Award. Dit onderzoek werd ook gefinancierd door het opstarten van de middelen voor onderzoek (MZ).
Riferimenti
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
