Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em
Summary
Cartographie génétique inductible Fate (GIFM) les marques et les cellules des pistes avec un contrôle spatial et temporel bien<em> In vivo</em> Et élucide comment les cellules d'une lignée génétique spécifique contribuer au développement et les tissus adultes. Démontré ici sont les techniques requises pour le sort des embryons de souris E12.5 carte pour l'analyse et à épifluorescence explant.
Abstract
Le destin des cartes sont générées par le marquage et le suivi des cellules in vivo pour déterminer comment les progéniteurs de contribuer à des structures spécifiques et des types de cellules dans le développement et tissus adultes. Une avance de ce concept est G enetic j'ai mangé nducible F M apping (GIFM), reliant l'expression des gènes, le destin des cellules, et les comportements des cellules in vivo, pour créer des cartes basées sur le destin lignée génétique.
GIFM exploite X-créer des lignes où X est un gène ou un ensemble d'éléments de régulation génique qui confère une expression spatiale d'une protéine bactériophage modifié, la recombinase Cre (CREER T). CREER T contient une version modifiée du e r strogen domaine eceptor liaison du ligand qui rend CREER T séquestré dans le cytoplasme en l'absence du tamoxifène. La liaison du tamoxifène communiqués T CREER, qui translocation vers le noyau et la recombinaison de médiateur entre des séquences d'ADN flanqué de sites loxP. En GIFM, la recombinaison se produit généralement entre un loxP flanquée Arrêtez cassettes précédant un gène rapporteur comme la GFP.
Les souris sont élevés pour contenir une région ou d'une cellule spécifique du type CREER et un allèle journaliste conditionnelle. Les souris non traitées seront pas marquer parce que la cassette Arrêt à la journaliste empêche la transcription supplémentaires du gène rapporteur. Nous administrons le tamoxifène par gavage oral à chronométré enceintes femelles, ce qui permet un contrôle temporel de CREER T libération et la translocation vers le noyau ultérieures retirer la cassette d'arrêt de la journaliste. Après recombinaison, l'allèle journaliste est constitutivement et heritably exprimé. Cette série d'événements tels que les marques les cellules de leur histoire génétique est indélébile enregistrées. Le journaliste recombinés sert ainsi un traceur de haute fidélité lignée génétique qui, une fois sur, est découplée de l'expression des gènes initialement utilisé pour le lecteur T CREER.
Nous appliquons GIFM de souris pour étudier le développement normal et déterminer la contribution des lignées génétiques à des types de cellules adultes et des tissus. Nous utilisons également GIFM à suivre sur les cellules mutantes origines génétiques pour mieux comprendre les phénotypes complexes qui imitent traits saillants de troubles génétiques humains.
Cet article vidéo guide les chercheurs grâce à des méthodes expérimentales pour appliquer avec succès GIFM. Nous démontrons la méthode utilisant notre bien caractérisés Wnt1-CREER T; souris mGFP en administrant le tamoxifène à jour embryonnaire (E) 8.5 par gavage suivie par dissection à E12.5 et l'analyse par stéréomicroscopie épifluorescence. Nous démontrons également comment les micro-domaines disséquer le destin tracé pour la préparation ou l'analyse FACS explant et disséquer les adultes destin tracé cerveaux pour monter toute l'imagerie fluorescente. Collectivement, ces procédures permettent aux chercheurs d'aborder des questions essentielles en biologie du développement et des modèles de maladie.
Protocol
Discussion
Le système GIFM que nous avons démontré peut être utilisé pour répondre à un large éventail de questions dans une variété de processus cellulaires. Par exemple, des souris conçues avec des pilotes Cre différentes peuvent être utilisées pour cibler n'importe quel type cellulaire, tissulaire ou de la lignée génétique de l'intérêt. En outre, parce que le tamoxifène peut être administré à n'importe quel point dans le temps embryonnaire ou postnatale, la recombinaison peut être ciblée sur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à S. Arber pour les souris mGFP et aux membres du laboratoire de Zervas qui critique lu le document et fourni une assistance technique. A. Brown a été soutenue par une science du cerveau d'été Prix Kaplan Graduate Research. E. Normand a été soutenue par une bourse de la science du cerveau programme Graduate Research. Cette recherche a également été financée par des fonds de recherche de démarrage (MZ).
Riferimenti
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
