גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em
Summary
מיפוי גנטי הגורל ועין מתנהלת (GIFM) סימני עקבות תאים עם שליטה במרחב ובזמן קנס<em> In vivo</em> ו מבהיר כיצד תאים משושלת גנטית ספציפית לתרום בפיתוח רקמות בוגרות. הפגינו הנה טכניקות נדרש גורל המפה E12.5 עוברי עכבר לניתוח epifluorescent ו explant.
Abstract
מפות הגורל נוצרות על ידי סימון ומעקב אחר תאים in vivo כדי לקבוע כיצד אבות לתרום מבנים ספציפיים סוגי תאים בפיתוח רקמות מבוגר. מראש המושג הזה הוא אני G enetic nducible F אכלו M apping (GIFM), המקשר ביטוי גנים, גורל התא, והתנהגויות תא in vivo, כדי ליצור מפות גורל מבוסס על השושלת הגנטית.
GIFM מנצל X-קואל קווי כאשר X הוא גן או קבוצת גנים גורמים רגולטוריים אשר מקנה הביטוי המרחבי של חלבון bacteriophage שונה, Cre recombinase (קואל T). קואל T מכיל שונה דואר strogen r תחום eceptor ליגנד מחייב אשר הופך קואל T מוחרם בציטופלסמה בהיעדר התרופה טמוקסיפן. הכריכה של טמוקסיפן משחרר קואל T, אשר translocates לגרעין ו רקומבינציה מתווכת בין רצפי DNA מוקף אתרים loxP. ב GIFM, רקומבינציה מתרחשת בדרך כלל בין loxP מוקף הפסק הקלטת הקודמת גן הכתב כגון GFP.
עכברים הם גידלו להכיל או אזור או סוג תא ספציפי קואל ו אלל כתב מותנה. עכברים שלא טופלו בחומר לא יהיה סימון כי קלטת עצור הכתב מונע שעתוק נוסף של הגן הכתב. אנו לנהל טמוקסיפן ידי gavage אוראלי מתוזמן נשים בהריון, אשר מספק שליטה הזמני של שחרור T קואל ו טרנסלוקציה לאחר גרעין הסרת קלטת עצור מן הכתב. בעקבות רקומבינציה, את האלל הוא כתב constitutively והביע heritably. זו סדרה של אירועים סימני תאים כאלה שההיסטוריה הגנטי שלהם נרשם בל יימחה. הכתב recombined ובכך משמש נותב איכות גבוהה שושלת גנטית, פעם אחת, הוא מנותקים ביטוי הגן השתמשו בתחילה לנהוג T קואל.
אנו מיישמים GIFM בעכבר ללמוד התפתחות תקינה ועל תרומתו לבירור של שושלות גנטיות סוגי תאים ורקמות מבוגר. בנוסף, אנו משתמשים GIFM לעקוב תאים על רקע גנטי מוטציה כדי להבין טוב יותר פנוטיפים מורכבים המחקות המאפיינים הבולטים של הפרעות גנטיות האדם.
מאמר זה וידאו מדריכים החוקרים באמצעות שיטות ניסיוניות בהצלחה להחיל GIFM. אנו מדגימים את השיטה באמצעות מאופיין היטב שלנו Wnt1-T קואל, עכברים mGFP ידי מתן טמוקסיפן ביום עובריים (E) 8.5 gavage דרך הפה ואחריו לנתיחה בבית E12.5 וניתוח על ידי stereomicroscopy epifluorescence. אנחנו גם מדגימים כיצד מיקרו לנתח תחומים גורל ממופה להכנת explant או ניתוח FACS ו לנתח מבוגר גורל ממופה מוחות עבור הדמיה הר שלם ניאון. ביחד, נהלים אלה לאפשר לחוקרים לענות על שאלות קריטיות בביולוגיה התפתחותית ומודלים המחלה.
Protocol
Discussion
המערכת GIFM שאנחנו הוכיחו יכול לשמש כדי לענות על מגוון רחב של שאלות במגוון של תהליכים תאיים. למשל, בעכברים מהונדסים עם נהגים שונים Cre יכול לשמש מטרה לכל סוג תא, רקמה או שושלת היוחסין הגנטי של עניין. בנוסף, בגלל טמוקסיפן יכול להינתן בכל נקודת זמן עובריים או לאחר הלידה, רקו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ס Arber עבור העכברים mGFP ולחברי במעבדה Zervas מי אנושות לקרוא את העיתון וסיפקה סיוע טכני. א 'בראון נתמכה על ידי המוח המדע פרס קפלן קיץ מחקר לתארים מתקדמים. א Normand נתמכה על ידי מדעי המוח פרס תוכנית מחקר לתואר שני. מחקר זה מומן גם על ידי קרנות מחקר הזנק (MZ).
Riferimenti
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
