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유전자 Inducible의 운명 매핑에 대한 실용적인 접근법 : 셀을 선택하고 추적하는 비주얼 가이드 VIVO에서</em

Published: December 30, 2009
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Summary

유전자 Inducible의 운명 매핑 (GIFM) 마크와 훌륭한 공간과 시간적 제어 트랙 세포<em> 생체내에</em> 그리고 특정 유전 혈통의 세포가 개발하고 성인 조직에 기여하는 방법을 elucidates. epifluorescent 및 explant 분석을위한 운명지도 E12.5 마우스 배아에 필요한 기술은 여기에 보여주었다.

Abstract

운명의지도 progenitors가 개발 및 성인 조직에서 특정 구조 및 세포 유형에 기여하는 방법을 결정하는 생체내의 세포를 표시 및 추적에 의해 생성됩니다. 이런 개념에서 사전에 내가 유전자 혈통에 따라 운명이지도를 만드는, F는 유전자 발현, 세포의 운명, 그리고 생체내 세포의 동작을 연결, M apping (GIFM)를 먹은 nducible G enetic입니다.

GIFM 이용 X – 크리어 라인 여기서 X는 수정된 박테리오 파지 단백질, Cre 호텔 recombinase (크리어 T)의 공간적 표현을 수여 유전자 규제 요소 유전자 또는 집합입니다. 크리어 T는 크리어 T를 렌더링으로 수정된 전자 strogen R eceptor의 리간드 바인딩 도메인을 포함하고 약물 tamoxifen의 부재에있는 세포질에서 분리된. loxP 사이트 둘러싸인 DNA 시퀀스 사이의 핵 및 mediates의 재조합에 translocates tamoxifen 출시 크리어 T의 결합. loxP 그런 GFP로 기자의 유전자를 앞에 카세트를 중지 어귀 사이 GIFM에서 재조합 일반적으로 발생합니다.

마우스는 어느 지역 또는 셀 타입 특정 크리어 및 조건부 기자 allele을 포함, 훈련하고 있습니다. 기자의 중지 카세트의 리포터 유전자의 추가 전송을 방지하기 때문에 치료 생쥐가 표시가 없습니다. 우리는 크리어 T 릴리스와 기자의 중지 카세트를 제거 핵에 후속 translocation의 시간적 제어를 제공 초과 – 임신 여성에 경구 gavage으로 tamoxifen을 관리할 수 있습니다. 재조합 다음, 기자의 allele은 constitutively하고 heritably 표시됩니다. 사건의이 시리즈는 자신의 유전자의 역사가 기록됩니다 indelibly 그러한 세포를 표시합니다. recombined 기자는 따라서, 한번에, 처음 크리어의 T를 운전하는 데 사용되는 유전자 발현의 uncoupled는 높은 충실도 유전자 혈통의 추적 역할을합니다.

우리는 성인 세포 유형과 조직에 유전 lineages의 정상적인 발전과 확인할 기여를 공부하기 위해 마우스 GIFM를 적용합니다. 우리는 또한 더 나은 인간의 유전 질환의 돌출 기능을 모방 복잡한 phenotypes을 이해하는 돌연변이 유전자 배경에 세포를 따라 GIFM 사용합니다.

실험 방법을 통해이 동영상이 문서에서는 가이드 연구자를 성공적으로 GIFM을 적용합니다. 우리는 잘 특징 Wnt1 – 크리어 T를 사용하는 방법을 보여줍니다; E12.5에서 절개 및 epifluorescence stereomicroscopy에 의해 분석하여 다음 구두 gavage 통해 배아 일 (E) 8.5에서 tamoxifen을 투여하여 mGFP 마우스. 우리는 또한 explant 준비 또는 외과 분석을위한 운명 매핑된 도메인을 마이크로 해부하다 및 전체 마운트 형광 이미징을위한 성인 운명 매핑 두뇌를 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 총체적으로,이 절차는 연구자가 발달 생물학과 질병 모델에서 중요한 질문을 해결하실 수 있습니다.

Protocol

Tamoxifen의 준비 및 구내 Gavage 절차 (E8.5) 사전 예열 옥수수 기름에 tamoxifen을 해소하여 tamoxifen의 20 MG / ML 재고 솔루션을 준비합니다. 37 솔루션을 품어 ° C nutator과 간헐적으로 소용돌이로 2 시간. 4 광 저장 ° C에서 tamoxifen 주식을 보호하고, 1 개월 최대 사용합니다. 그리고 유전자 특정 크리어 T의 allele과 기자 allele 모두를 나르는 남자, 운명 매핑 실험 들?…

Discussion

우리가 보여준 그 GIFM 시스템은 셀룰러 프로세스의 다양한 질문에 다양한 답변을하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 Cre 호텔 드라이버 엔지니어링 생쥐는 모든 세포 유형, 조직 또는 관심있는 유전자 혈통을 대상으로 사용할 수 있습니다. tamoxifen 어떤 배아 또는 출생 후의 시점에 시행 될 수 있기 때문에 또한, 재조합은 어떤 관련이 발달 단계에 타겟팅할 수 있습니다. 이 시스템의 …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 mGFP 마우스에 대한 S. 아버하고 비판적으로 신문을 읽고 기술 지원을 제공하는 Zervas 연구실의 구성원에 감사하고 있습니다. A. 브라운은 뇌 과학 카플란 여름 대학원 연구 상을 지원했다. E. 노르망는 뇌 과학 프로그램 대학원 연구 상을 지원했다. 이 연구는 또한 시동 연구 자금 (MZ)에 의해 재정 지원되었다.

Riferimenti

  1. Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
  2. Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
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Citazione di questo articolo
Brown, A., Brown, S., Ellisor, D., Hagan, N., Normand, E., Zervas, M. A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo. J. Vis. Exp. (34), e1687, doi:10.3791/1687 (2009).

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