En praktisk inställning till genetiska inducerbara Fate Mapping: En visuell guide till Mark och spår celler In Vivo</em
Summary
Genetiska inducerbara Fate Mapping (GIFM) märken och spår celler med fina tid och kontroll<em> In vivo</em> Och belyser hur celler från en viss genetisk härstamning bidra till att utveckla och vävnader vuxen. Visade här är de tekniker som krävs för att ödet kartan E12.5 musembryon för epifluorescent och Explantation analys.
Abstract
Ödet kartor genereras av märkning och spårning av celler in vivo för att avgöra hur stamceller bidrar till specifika strukturer och celltyper i att utveckla och vuxen vävnad. Ett förskott i detta begrepp är G enetic jag nducible F åt M apping (GIFM) som förbinder genuttryck, cell öde och beteenden cell in vivo, för att skapa öde kartor som bygger på genetisk härstamning.
GIFM utnyttjar X-CreER linjer där X är en gen eller en uppsättning gener reglerande element som ger rumsliga uttryck för en modifierad bakteriofag protein, Cre recombinase (CreER T). CreER T innehåller en modifierad e strogen r eceptor ligandbindande domänen som gör CreER T bundet i cytoplasman i avsaknad av läkemedlet tamoxifen. Bindningen av tamoxifen releaser CreER T, som translocates till kärnan och förmedlar rekombination mellan DNA-sekvenser flankeras av loxP webbplatser. I GIFM sker rekombination vanligtvis mellan en loxP flankeras Stoppa kassetten innan en reporter gen som GFP.
Möss är avlade för att innehålla antingen en region-eller cell typspecifika CreER och en villkorlig reporter allel. Obehandlad möss kommer inte att ha märkning eftersom Stoppa kassetten i reportern förhindrar ytterligare utskrift av reporter genen. Vi administrerar tamoxifen via oral sondmatning till tidsinställd-dräktiga honor, vilket ger temporal kontroll över CreER T utsläpp och efterföljande translokation till kärnan bort Stoppa kassetten från reportern. Efter rekombination är reporter allelen konstitutivt och heritably uttryckt. Denna serie av händelser markerar celler så att deras genetiska historia outplånlig spelas in. Den rekombinerat reporter fungerar alltså som en high fidelity genetisk härstamning spårämne som, när den är frikopplas från genuttryck användes ursprungligen för att driva CreER T.
Vi tillämpar GIFM i mus för att studera normal utveckling och fastställa bidrag genetiska linjerna till vuxen celltyper och vävnader. Vi använder också GIFM följa celler på mutant genetisk bakgrund för att bättre förstå komplexa fenotyper som efterliknar framträdande dragen i människans genetiska sjukdomar.
Denna video artikeln vägleder forskare genom experimentella metoder att framgångsrikt ansöka GIFM. Vi visar metoden att använda vår välkarakteriserade Wnt1-CreER T; mGFP möss genom att administrera tamoxifen på embryonala dag (E) 8,5 via oral sondmatning följt av dissektion vid E12.5 och analys med epifluorescence stereomikroskopi. Vi visar också hur mikro-dissekera öde kartlagda områden för Explantation förberedelser eller FACS analys och dissekera vuxna öde-mappade hjärnor för hela montera lysrör avbildning. Tillsammans står dessa förfaranden låta forskare att hantera kritiska frågor i utvecklingsbiologi och modeller sjukdom.
Protocol
Discussion
Det GIFM system som vi har visat kan användas för att besvara en rad frågor i olika cellulära processer. Till exempel kan möss konstruerad med olika Cre förare kan användas för att rikta alla celltyper, vävnader eller genetisk härstamning av intresse. Dessutom, eftersom tamoxifen kan administreras när som embryonala eller postnatal tidpunkt kan rekombination riktas till alla relevanta utvecklingsstadiet. Den rumsliga och tidsmässiga kontrollen av detta system är idealiska för att undersöka hur celler som …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för S. Arber för mGFP möss och till medlemmar i Zervas labb som kritiskt läsa tidningen och gav tekniskt bistånd. A. Brown fick stöd av en Brain Science Kaplan Sommar Graduate Research Award. E. Normand stöddes av en Brain Science Program Graduate Research Award. Denna forskning har också finansierats av start forskningsmedel (MZ).
Riferimenti
- Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system. Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).
- Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1. Neuron. 43, 345-357 (2004).
