Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Summary

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri<em> In vivo</em> Ve belirli bir genetik soy hücreleri, gelişmekte olan ve yetişkin dokularda katkıda bulunmak nasıl izah etmektedir. Epifluorescent ve eksplant analizi için kader haritası E12.5 fare embriyoları için gerekli teknikleri burada gösterdi.

Abstract

Kader haritalar atalarıdır, gelişmekte olan ve yetişkin doku özel yapılar ve hücre tiplerinin nasıl katkıda belirlemek için, in vivo hücre işaretleme ve izleme tarafından üretilir. Bu kavramı bir ilerleme genetik soy dayalı kaderi haritaları oluşturmak için, F, M aritalandırma (GIFM) gen ekspresyonu, hücre kaderi, ve in vivo hücre davranışları birbirine bağlayan yedik nducible, G enetic.

GIFM patlatır X-CreER hatları burada X, değiştirilmiş bir bakteriyofaj protein, Cre recombinase ^{(CreER T)} mekansal ifade bahşeder gen ya da gen düzenleyici elemanlar bir set. ^{CreER T,} T CreER kılan bir değiştirilmiş bir e strogen r eceptor ligand bağlayıcı etki alanı içeren ilaç tamoksifen yokluğunda sitoplazma saklamış. LoxP siteleri tarafından çevrili DNA dizilimleri arasındaki çekirdek ve aracılık rekombinasyon translocates tamoksifen bültenleri CreER ^T, bağlayıcı değildir. LoxP bir muhabir gibi GFP geninin önceki kaset Dur çevrili arasında GIFM, rekombinasyon genellikle oluşur.

Fare, bir bölge veya hücre tipine özgü CreER ve koşullu bir muhabir aleli içeren cins vardır . Muhabir Durdur kaset muhabir gen transkripsiyonu önler, çünkü tedavi görmeyen farelere işaretleme olmayacaktır. CreER ^T serbest bırakılması ve muhabir Durdur kaset çıkarmadan çekirdeğine sonraki translokasyon zamansal kontrolü sağlar zamanlı hamile kadın, ağızdan sonda ile tamoksifen yönetmek. Rekombinasyon sonra, muhabir allel yapısal ve heritably ifade. Bu olaylar dizisi, bu tür hücrelerin genetik geçmişi silinmez kayıtlı olduğunu işaret ediyor. Recombined muhabiri, böylece, bir kez, ^{başlangıçta} CreER T sürmek için kullanılan gen ekspresyonu çözüldükten bir yüksek sadakat genetik soy tracer olarak hizmet vermektedir.

Biz genetik soy, yetişkin hücre tipleri ve dokuların normal gelişimini ve katkısını tespit çalışma fare GIFM geçerlidir. Ayrıca hücreleri mutant genetik kökenden insan genetik bozukluklar göze çarpan özellikleri taklit karmaşık fenotipleri daha iyi anlamak için takip etmek GIFM kullanabilirsiniz.

Deneysel yöntemlerle kılavuzları Bu video makalede araştırmacılar başarıyla GIFM uygulamak için. Biz iyi karakterize Wnt1-CreER ^T yöntemi kullanarak göstermek; E12.5 diseksiyon ve Epifloresans stereomicroscopy analiz ağızdan sonda ile embriyonik gün (E) 8.5 tamoksifen idare tarafından mGFP fareler. Ayrıca eksplant hazırlama veya FACS analiz kaderi eşlenen etki alanı mikro-incelemek ve tüm montaj floresan görüntüleme için yetişkin kader eşlenen beyinleri teşrih nasıl göstermektedir. Toplu olarak, bu işlemler, araştırmacılar, gelişim biyolojisi ve hastalık modelleri kritik soruları yanıtlamak için izin verir.

Protocol

Tamoksifen hazırlanması ve ağızdan sonda Prosedürü (E8.5) Önceden ısıtılmış mısır yağı tamoksifen eriterek tamoksifen bir 20 mg / ml stok solüsyonu hazırlayın. 37 ° çözüm inkübe ° C nutator ve aralıklı olarak vorteks üzerinde 2 saat. 4 ışık, mağaza ° C tamoksifen stok koruyun ve bir aya kadar kullanabilirsiniz. Bir genin özel CreER T alleli ve bir muhabir aleli taşıyan bir erkek; kaderi haritalama deneyler için, Swiss Webst…

Discussion

Olduklarını ortaya koyduk GIFM sistemi geniş bir yelpazede hücresel süreçlerin çeşitli soruları cevaplamak için kullanılacak. Örneğin, farklı Cre sürücüleri ile mühendislik fareler, herhangi bir hücre tipi, doku veya ilgi genetik soy hedef kullanılabilir. Buna ek olarak, tamoksifen embriyonik ya da doğum sonrası herhangi bir zaman noktasında idare olabilir, çünkü, rekombinasyon, ilgili herhangi bir gelişme aşamasına hedef olabilir. Bu sistemin mekansal ve zamansal kontrol belirli genleri ifa…