Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Lineerleştirilmiş λ DNA bir iplikçik sonunda bir biotin, ve aynı iplikli diğer ucunu bir digoxigenin benzer parçaları değiştirilir. Biotinlenmiş sonuna Fonksiyonlu cam lamel ve küçük bir boncuk digoxigeninated sonuna eklenir. Bir akış hücre yüzeyinde bu DNA boncuk hayvan iplerini montaj, laminer akış, boncuk üzerinde sürükleyin kuvvet uygularlar uygulanmasına olanak veriyor. Sonuç olarak, DNA ve paralel akış hızı (Şekil 1) tarafından belirlenen bir kuvvet lamel yüzeye yakın gerilir. DNA uzunluğu boncuk pozisyonunun izlenmesi ile ölçülür. Tek ve çift iplikli DNA arasındaki uzunluk farklılıkları çatal çoğaltma proteinlerin aktivitesini gerçek zamanlı bilgi elde etmek için kullanılmaktadır. Boncuk pozisyon ölçme gevşemek DNA ve polimerizasyon (Şekil 2) oranları ve processivities hassas belirliyor.
Protocol
1. DNA replikasyonu Şablonu Reaksiyon için DNA replikasyon çatal oluşturmak için oligonükleotidler tavlama tarafından değiştirilmiş Lineerleştirilmiş λ DNA. Ayrıca, biotin λ DNA iplikçik sonuna kadar bağlı olduğu ve bir digoxigenin benzer parçaları aynı iplikçik 1 diğer ucuna takılı. Malzemeler: bakteriyofaj λ DNA Oligonükleotidler: biotinlenmiş çatal kol (A: 5'-biotin-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGC…
Discussion
Laminer akış boncuklar üzerinde uyguladığı sürtünme kuvveti çoğaltma proteinler enzimatik faaliyetlerin etkisi olmadığından emin olmak için çok önemlidir. Örneğin, 0.012 ml / dk akış oranına karşılık gelen 3 pN gücü önde gelen iplikçik DNA replikasyon etkilemez. Ancak enzimatik faaliyetleri koordine DNA sentezi sırasında yer alan etkilemez ve bu nedenle 1.5 pN azaltılmalıdır. Sürtünme kuvveti kolayca akış hızını veya akış kanalı 5 genişliği değiştirerek kontrol e…
Acknowledgements
Paul Blainey, Jong-Bong Lee ve Samir Hamdan uzanan DNA testinin geliştirilmesi yardımıyla oldu. Bu çalışma, Charles Richardson (GM54397) ve Antoine van Oijen (GM077248) Sağlık hibe Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Bacteriophage λ DNA
New England Biolabs
N3011L
DNA Oligonucleotides
Integrated DNA Technologies
T4 DNA Ligase
New England Biolabs
M0202L
T4 Polynucleotide Kinase
New England Biolabs
M0201L
α-digoxigenin Fab
Roche
11214667001
Tosyl Activated Beads
Dynal/Invitrogen
142-03
Magnetic Separator
Invitrogen
Dynal MPC
3-aminopropyl-triethoxysilane
Sigma
A3648
Other aminosilanes can be used or mixed with non-amine reactive silanes for sparser surfaces
Succinimidyl propionate PEG
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Biotin-PEG-NHS
Nektar
Similar PEGs can be purchased from Nanocs, CreativePEGWorks, etc.
Double-sided tape
Grace BioLabs
SA-S-1L
100 μm thickness
Quartz slide
Technical Glass
20 mm (W)x 50 mm (L)x 1mm (H)
Size to fit on coverslips. Drill holes with diamond-tip drill bits (DiamondBurs.net)
Polyethylene tubing
Becton Dickinson
427416
0.76 mm ID, 1.22 OD
Other size tubing can be substituted.
Streptavidin
Sigma
S4762
Make 1 mg/mL solution, 25 μL aliquots in PBS pH 7.3
Deoxyribonucleotide triphosphate solution mix
New England Biolabs
N0447
Inverted Optical Microscope with 10X Objective
Olympus
Olympus IX-51
Permament rare-earth magnet
National Imports
www.rare-earth-magnets.com
CCD Camera
QImaging
Rolera-XR Fast 139
Syringe Pump
Harvard Apparatus
11 Plus
Operate in refill mode to facilitate solution changes
Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J. Vis. Exp. (37), e1689, doi:10.3791/1689 (2010).