विष प्रेरण और से प्रोटीन निकालना Fusarium एसपीपी. प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए संस्कृति

Summary

कवक प्रजातियों में प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन निष्कर्षण प्रोटिओमिक (MIAPE) प्रयोग दिशा निर्देशों के बारे में कम से कम जानकारी के साथ अनुसार मानकीकरण के उच्च स्तर को पूरा किया जा आवश्यकता है. हम मौजूद एक वीडियो प्रोटोकॉल है कि विष प्रेरण और से प्रोटीन निकासी के दौरान प्रायोगिक पूर्वाग्रह न्यूनतम करने के लिए एक प्रक्रिया शामिल है<em> Fusarium एसपीपी.</em

Abstract

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc… have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.

The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1).

Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Protocol

प्रोटोकॉल अपने पूरा करने के लिए 16 दिनों के की आवश्यकता है. समय सीमा संख्या 1 में विस्तृत है. बफर तैयार करने के लिए विवरण Lysis बफर (नमूना प्रति 3ml) की तैयारी. धोने बफर (नमूना प्रति 50ml) तैयार करना. इस बफर पूर्व ठंडा होना चाहिए और संग्रहीत फ्रीजर में -20 डिग्री सेल्सियस पर और आगे के विश्लेषण के जब तक पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा है. वर्षा बफर (नमूना प्रति 20ml) तैयार करना. इस बफर पूर्व ठंडा होना चाहिए और संग्रहीत फ्रीजर में -20 डिग्री सेल्सियस पर जब तक जरूरत है और पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा है. काम preferentially ठंड चैम्बर में चाहिए किया 4 बजे ° जा सी. फफूंद प्रजातियों प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तीन उपभेदों के लिए उनके morphological विशेषताओं और अनुवाद बढ़ाव कारक – अल्फा एक विश्लेषण के आधार पर Fusarium graminearum में वर्गीकृत किया गया (O'Donnell एट अल, 1998. ) इन उपभेदों सीआरपी गेब्रियल Lippmann संग्रह था और बनाए रखा गया और पर संग्रहीत – 80 ° C 15 में% ग्लिसरॉल है. Mycelia की तैयारी कवक V8 पर 4 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस प्रकाश और अंधेरे की अवधि बारी प्रत्येक 12 घंटे में खेती थे. संस्कृतियों को एक बाँझ ब्लेड और इन संस्कृतियों के टुकड़े थे 250 मिलीलीटर Erlenmeyer विष उत्प्रेरण मीडिया के 100 एमएल युक्त बोतल टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया उपयोग खंडित थे. Mycelia 10 दिनों के बाद काटा गया और एक बाँझ फिल्टर के साथ संस्कृति को फ़िल्टर करके मध्यम से अलग थे. Mycelia बाँझ पानी के साथ 3 बार मध्यम अवशेष और अन्य यौगिकों को दूर धोया गया. हम तो तुरंत तरल नाइट्रोजन जोड़कर कोशिकाओं जम और -80 पर नमूने रखा डिग्री सेल्सियस प्रोटीन निष्कर्षण के सामान्य विवरण प्रोटीन के नमूने आंकड़ा 3A और 3B में वर्णित विधि का उपयोग कर निकाले गए थे. Fusarium नमूने तरल नाइट्रोजन में जमीन थे और पाउडर 10 मिलीलीटर Teflon ट्यूबों में एकत्र की गई थी. नमूने तब lysis बफर के साथ 30 मिनट incubated, 10 मिनट के लिए उबला हुआ, और कमरे के तापमान (15 मिनट के लिए 12000g) पर 2 बार centrifuged. supernatants एकत्र थे और -20 ° सी में incubated रात वर्षा बफर के साथ. ° 30000g सी 4 बजे centrifugation के बाद 45 मिनट के लिए, उपजी प्रोटीन के छर्रों ठंड डीटीटी युक्त एसीटोन के साथ 3 बार धोया गया. अंत में, छर्रों हवा सूखे थे और प्रोटीन लेबलिंग बफर में resolubilized थे, 8 से पीएच समायोजन. 30 मिलीलीटर की एक उप नमूना कुल प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए हटा दिया गया था और शेष सतह पर तैरनेवाला -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन तक संग्रहीत किया गया था. चित्रा 1 प्रक्रिया की समयरेखा. चित्रा 2 एकाधिक नमूना प्रसंस्करण ऑपरेटरों के लिए योजना . चित्रा 3a. कृपया चित्रा 3b. आंकड़ा 3a का एक बड़ा संस्करण, या यहाँ आंकड़ा 3b का एक बड़ा संस्करण के लिए यहाँ क्लिक करें . आंकड़े 3a ख प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया के लिए फ्लो चार्ट (एक: पहला दिन, बी: दूसरे दिन). चित्रा 4 प्रोटीन के अर्क के 1D तस्वीर. प्रोटीन लावा पर्पल के साथ दाग था कि जेल के अंत करने के लिए नीले रंग की पूरी प्रवास तक चला गया. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 4 का एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

कवक जीव विज्ञान के डोमेन के भीतर प्रोटिओमिक दृष्टिकोण में हाल ही में ब्याज (के रूप में किम एट अल, 2007 में समीक्षा की) इस तकनीक का उपयोग करके प्रकाशनों का एक बढ़ा संख्या के लिए नेतृत्व किया. प्रोटीन निकासी के लिए तरीके निष्कर्षण प्रक्रियाओं का एक संयोजन पर निर्भर हैं, वे अक्सर शायद ही methodological अनुभागों में वर्णित है और संभावित समस्या निवारण की आवश्यकता है विधियों के साथ निपटने में विशेषज्ञता की आवश्यकता है.

अन्य "omics" दृष्टिकोण, के लिए के रूप में नमूना और डाटा प्रोसेसिंग के लिए मानकों की स्थापना के लिए आवश्यक है क्रम में करने के लिए विश्वसनीय वैज्ञानिक जानकारी उत्पन्न. इसके अलावा नमूनों और हेरफेर की प्रक्रिया को पर्याप्त रूप से वर्णित क्रम में अलग "omics" प्रयोगों के बीच साझा परिणाम व्याख्या की अनुमति चाहिए. यह पूरी तरह से पार डेटा जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, metabolomics, में खनन की संभावनाओं को शोषण करने के लिए आवश्यक हो जाएगा … (मॉरिसन एट अल., 2006). प्रोटिओमिक प्रयोग के बारे में न्यूनतम जानकारी का मसौदा तैयार किया गया है और कार्य समूहों की स्थापना की गई है क्रम में करने के लिए एक प्रयोग के सभी पहलुओं (जेल वैद्युतकणसंचलन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, आण्विक सहभागिता, प्रोटीन संशोधन, प्रोटिओमिक्स सूचना, नमूना प्रसंस्करण) से निपटने. फिलहाल कोई परिभाषित जानकारी नमूना प्रसंस्करण प्रक्रिया पर उपलब्ध हैं. प्रोटिओमिक अध्ययन के अंतिम गुणवत्ता निर्धारित क्रम में प्रक्रियाओं है कि MIAPE दिशा निर्देशों के ढांचे के भीतर मानकीकरण में वृद्धि कर सकते हैं (टेलर एट अल., 2007) को लागू करने में प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रियाओं के महत्व को देखते हुए, हम एक वीडियो का नमूना ब्यौरा प्रोटोकॉल के उपयोग का प्रस्ताव प्रसंस्करण. प्रयोगों के वीडियो वर्णन में काफी योगदान करने के लिए नमूना प्रसंस्करण पर जानकारी है कि "omics" प्रयोगों (Pasquali, 2007) के बेहतर reproducibility में परिणाम सकता है की संख्या में वृद्धि हो सकती है.

दरअसल, प्रयोगशालाओं भर में reproducibility के एक मौलिक आवश्यकता है क्रम में प्रोटिओमिक्स परिणाम (http://www.fixingproteomics.org) की वैधता की गारंटी है. विभिन्न इंस्ट्रुमेन्टेशन्स और विभिन्न ऑपरेटरों के नमूने से छेड़छाड़: ​​reproducibility के पार प्रयोगशाला दो कारकों से प्रभावित होता है.

वर्णित प्रोटोकॉल में, हम प्रदर्शन करने का प्रस्ताव जैविक प्रतिकृति एकाधिक ऑपरेटरों (2 चित्रा और वीडियो) को शामिल करने के लिए डेटा (यानी परिणामों के तकनीकी परिवर्तन खाते में ले लिया है) की विश्वसनीयता में वृद्धि.

प्रोटीन निकासी के लिए वर्णित की प्रक्रिया एसडीएस और हीटिंग पर आधारित है. यह पहले एक अच्छा शुद्धता और प्रोटीन की मात्रा (1996 ब्रिज) की गारंटी करने के लिए दिखाया गया था. एसडीएस उबलते के साथ मिलकर सेल दीवारों, hydrophobic प्रोटीन घुल और oligomers के गठन रोकता है कि प्रोटीन के गर्भपात वर्षण. उबलते भी proteases की निष्क्रियता की अनुमति देता है. एक ही प्रभाव भी EDTA, PMSF और पूरा मिनी protease अवरोध करनेवाला के द्वारा उत्पादित है. डीटीटी में और प्रोटीन solubilization की सुविधा प्रोटीन के बीच डाइसल्फ़ाइड पुलों निकालता है.

IEF पहले एसडीएस हटायें आदेश में, प्रोटीन एसीटोन / / TCA डीटीटी से उपजी हैं. इसके अलावा, एसीटोन / / TCA डीटीटी वर्षण lipids, nucleic एसिड, लवण या / और phenolic यौगिकों के रूप में कुछ contaminants निकालने की अनुमति देता है जब इन यौगिकों मौजूद हैं. एसडीएस की तरह, इन अणुओं IEF के दौरान एक अच्छा प्रवास को रोकने. इस वर्षा के बाद, यह एसीटोन / डीटीटी, से उपजी प्रोटीन धो क्रम में TCA दूर के रूप में यह IEF के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं आवश्यक है.

एक अच्छा नमूना तैयार अच्छे परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है. इस के लिए, यह भी पर्यावरण से प्रोटीन पाउडर मुक्त दस्ताने के साथ काम कर रहे हैं और अच्छा प्रयोगशाला प्रथाओं का सम्मान के संक्रमण से बचने के लिए आवश्यक है. देखने की एक तकनीकी बिंदु से, वर्णित प्रोटोकॉल के भीतर, प्रोटीन की पर्याप्त मात्रा और शुद्धता को प्राप्त करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम दो चरणों रहे हैं. सबसे पहले, पीस चरण है जहां सेल के पूर्ण विनाश करने के लिए प्रोटीन रिहाई के लिए मौलिक है, और दूसरा, कुल प्रोटीन की शुद्धि, lipids, डीएनए और अन्य contaminants कि प्रोटीन के प्रवास के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बहुमत के हटाने शामिल चरण.

Materials

Media and solutions

PDA: 39 g Potato Dextrose Agar (Difco); 1 L distilled water.
V8 agar:  200 ml V8 (campbell’s, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (DIFCO), 800 ml distilled water

Toxin inducing media: 1g K₂HPO₄, 0.5g KCl, 0.5g MgSO₄ 7H₂O, 10 mg FeEDTA, 2g L glutamic acid, 10g sucrose in 1L of distilled water.

Lysis Buffer:

	100mL	Final concentration
Tris-HCL pH8	5mL	50mM	1M
SDS	2g or 10mL	2%	20%
DTT	500mL	10mM	2M
EDTA	20mL	0.1mM	0.5M
PMSF	200mL
Complete mini protease inhibitor	1 tablet
Water	Qsp

Precipitation Buffer:

	100mL	Final concentration
TCA	20mL	20%
DTT	0.1mL	0.1%
Aceton	Qsp

Washing Buffer:

	100mL	Final concentration
DTT	0.1mL	0.1%
Aceton	100mL

Labelling Buffer (store at -18°C in small aliquots):

	1mL	Final concentration
Urea	140 mg	7M
Thiourea	50 mg	2M
CHAPS	40 mg	4%
Tris	30 µL	30 mM
Water	1 mL