Het visualiseren van RNA Lokalisatie in Xenopus Eicellen

Summary

Visualisatie van<em> In vivo</em> RNA transport wordt gerealiseerd door micro-injectie van fluorescent gelabelde RNA transcripten in<em> Xenopus</em> Eicellen, gevolgd door confocale microscopie.

Abstract

RNA lokalisatie is een geconserveerd mechanisme van oprichting van celpolariteit. VG1 mRNA lokaliseert aan de plantaardige pool van Xenopus laevis oöcyten en handelt om ruimtelijk te beperken genexpressie van VG1 eiwit. Strikte controle van de VG1 distributie op deze manier is vereist voor een goede kiemlaag specificatie in de zich ontwikkelende embryo. RNA sequentie elementen in de 3 'UTR van het mRNA, de VG1 lokalisatie element (VLE) zijn vereist en voldoende zijn om rechtstreeks vervoer. De studie van de erkenning en het transport van VG1 mRNA in vivo, hebben we een beeldvormende techniek die een uitgebreide analyse van de trans-factor gericht transport mechanismen kan via een eenvoudige visuele uitlezing.

Te visualiseren RNA lokalisatie, we synthetiseren fluorescent gelabelde VLE RNA en microinject dit transcript in individuele eicellen. Na een eicel cultuur om het vervoer van de geïnjecteerde RNA toe te staan, eicellen staan ​​vast en uitgedroogd voorafgaand aan de beeldvorming door confocale microscopie. Visualisatie van mRNA lokalisatie patronen biedt een uitlezing voor het toezicht op de volledige route van RNA transport en voor het identificeren van rollen in regie RNA vervoer voor cis-werkende elementen binnen de transcriptie en trans-werkende factoren die binden aan de ELO (Lewis et al.., 2008, Messitt et al.., 2008). We hebben uitgebreid deze techniek door middel van co-localisatie met extra RNA en eiwitten (Gagnon en Mowry, 2009, Messitt et al.., 2008), en in combinatie met verstoring van motorische eiwitten en het cytoskelet (Messitt et al., 2008). Te probe mechanismen ten grondslag liggen mRNA lokalisatie.

Protocol

Deel 1: Transcriptie van fluorescent gelabelde mRNA. Lineariseren plasmide DNA dat het RNA lokalisatie element of andere relevante reeks en resuspendeer bij 1 ug / ul met DEPC behandeld H 2 O. De DNA-template moet stroomopwaarts promoter sites voor transcriptie door T7, SP6 of T3 RNA polymerase. Voeg de volgende reagentia om een ​​steriele 1,5 ml tube: a. 10X Tx buffer (zie M & M) 2 pi b. 20X cap / NTP mix (zie M & M) <t…

Discussion

Hier hebben we voorgesteld een protocol voor het visualiseren van mRNA lokalisatie in Xenopus oöcyten. Deze methode, met behulp van fluorescent gelabelde RNA-transcripten heeft een hogere signaal-ruisverhouding dan voorheen verkregen met digoxigenine-gelabeld transcripties en is eenvoudiger en sneller dan in-situ gebaseerde benaderingen (Mowry en Melton, 1992, Gautreau et al.., 1997). Met deze methode kunnen we engineer RNA-sequentie mutaties en snel te testen voor in vivo-functie. Verder, door gebrui…

Materials

10X Tx buffer

• 60 mM MgCl₂
• 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
• 20 mM spermidine-HCl

20x cap/NTP mix

• 10 mM CTP
• 10 mM ATP
• 9 mM UTP
• 2 mM GTP
• 20 mM G(ppp)G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 column

• Hydrate 5 g Sephadex G-50 beads (Sigma Aldrich) in 100 ml deionized H₂O. DEPC-treat for 30 min. and autoclave. Store incomplete stock at room temperature. Before use, add the following RNase-free solutions:
• 0.5 ml 0.2 M EDTA
• 1 ml 1 M Tris pH 8.0
• 0.5 ml 20% SDS
• Store complete G-50 solution at 4° C.
• Remove and discard the plunger from a 3 ml syringe (BD Biosciences) and place the barrel of the syringe into a 15 ml conical tube (Corning). Plug the syringe with a small amount of glass wool (a plug about half the size of a penny).
• Swirl complete G-50 solution to resuspend beads.
• Add 2 ml G-50 solution to the empty column.
• Spin for 1 minute at 1,000 x g in benchtop centrifuge.
• Add 200 μl DEPC-treated deionized H₂O to each column. Spin.
• Repeat wash twice more for a total of three washes.
• Remove syringe barrel to a fresh 15 ml conical tube.

Collagenase solution

• 75 mg collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich)
• 25 ml 0.1 M KPO₃+ (pH 7.4)

MBSH buffer

• 88 mM NaCl
• 1 mM KCl
• 2.4 mM NaHCO₃
• 0.82 mM MgSO₄ X 7H₂O
• 0.33 mM Ca(NO₃)₂ X 4H₂O
• 0.41 mM CaCl₂ X 6H₂O
• 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oocyte Culture Medium

• 50% L15 medium
• 15 mM HEPES (pH 7.6)
• 1 mg/ml insulin
• 100 mg/ml gentamicin
• 50 U/ml nystatin
• 50 U/ml penicillin
• 50 mg/ml streptomycin

MEMFA solution

• 0.1 M MOPS (pH 7.4)
• 2 mM EGTA
• 1 mM MgSO₄
• 3.7% formaldehyde

Computing RNA yield

• Determine CPM in “input” and “incorporated” samples using a standard scintillation counter.
• incorporation = (“incorporated”) / (10 x “input”)
• Typical incorporation values range between ~0.03 and 0.10.
• Maximum theoretical yields for different polymerases:
  T7, T3, SP6 – 2.64 μg
• Reaction yield in μg = (maximum yield of polymerase used) X (incorporation)
• Dilute RNA to 50 nM = (μg RNA) / 320 / (length of RNA in bases) / (5X10^-8)
• The reaction usually yields ~50-100 μl of RNA at 50 nM.