組織学、組織形態計測および蛍光色素分析のためのUndecalcified骨の準備

Summary

Undecalcified骨の組織学、臨床と研究のさまざまなアプリケーションのための重要な情報を提供します。それは、特に大きなサイズの標本で、技術的に困難です。このビデオでは、良質のセクションを生成するプロセスを示していますし、それらを克服することで技術的な問題とメソッドを示しています。

Abstract

Undecalcified骨組織は、骨のマイクロアーキテクチャを示しています。それは、骨代謝や骨形成と骨吸収に関する重要な情報を提供する骨の鉱化と細胞成分の両方を示しています。これは、臨床と研究のさまざまなアプリケーションにおいて非常に大きな重要性を持っています。それは、美しい画像^1を得られますし、そのような蛍光色素の評価や組織形態計測²のようなテクニックが可能になります。蛍光色素の分析ではカルシウムに結合する蛍光色素がその時点で鉱化量の定量化を可能にする特定の時点、で注入されている技術です。組織形態計測は、顕微鏡レベルで骨の定量化のプロセスです。

undecalcified骨の組織学を実行すると、特に大きなサイズの標本で、技術的に困難です。それは組織学を埋め込まれた標準的なパラフィンで使用されているものから技術の変化を必要とします。このビデオでは、良質のセクションを生成するプロセスを示していますし、それらを克服することで技術的な問題とメソッドを示しています。試料の準備、固定と処理が他の軟部組織と同様の方法で達成されている、しかし密度に起因すると骨の低透過性がかなり長く固定して、処理時間が必要とされる、多くの場合、数週間服用。埋め込みは、メタクリレート系樹脂などの骨に似てたり、同じ硬さと密度との支持体を使用して達成が、パラフィン浸透および埋め込みとは異なり、これは不可逆的な段階です。切片は、蛍光分析などの研究に最適な厚いセクションを、産生する研削することによって達成することができます。これは、最善のmacrotomeにダイヤモンドブレードを使用して実現されます。また、薄い切片を光学顕微鏡のために製造することができ、これは非常に鋭い刃でそりのミクロトームを使用して実現されます。そりミクロトームは、大規模な、ハードブロックに必要な追加の強度と安定性を提供します。樹脂埋込みのセクションは、実証されている汚れの様々な、で染色することができます。

Protocol

組織は、10％のリン酸塩を含む密閉容器にホルマリン溶液3をバッファに配置されます。蛍光分析は蛍光色素が光に敏感であるため、実行する場合は、光に最小限の露出を確認してください。 組織の方向が要求される確立。 サイズの試料をトリミング、正しい向きで、バンドを使用して見た。安全対策が守られることを確認します。試料はその後不透明な容器に入れている、の量は?…

Materials

Solvents:

• 10% Normal Buffered Formalin, Ethanol, Xylene and Butanol acid
  All histology grade, sulfur free.
  Grale Scientific Pty Ltd.
  http://www.grale.com.au

Moulds:

• Peel away, plastic moulds
  Grale Scientific

Slides:

• SUPERFROST PLUS Microscope slides
  Lomb Scientific Pty Ltd.
  http://www.lomb.com.au

Resin:

• GlycolMethacrylate Technovit 7100
  Heraeus Kulzer
  http://www.kulzer-technik.de/168/Products/Histology/Technovit_7100.htm
• Backing Block Resin- Technovit 3040 Histo block
  Heraeus Kulzer

Stains
(Reagents from Grale Scientific)

Goldner’s Trichrome stain

1. Weigert’s iron hemotoxylin (DeGroat)

a) Hemotoxylin solution
Hemotoxylin	1g
Absolute Alcohol	100mL
b) Iron Solution
30% aqueous ferric chloride	4mL
Hydrochloric acid (concentrated)	1mL
distilled Water	95mL

Filtered and added to equal volume of hemotoxylin immediately before stain used.

2. Ponceau-fuchsin-azophloxin stock solutions

a) Ponceau de xylidine solution
Ponceau de xylidine	0.75g
acid fuchsion	0.25g
Acetic Acid	1mL
mix, and add distilled water (100mL)
b) azophloxin solution
Azophloxin	0.5g
Acetic acid	0.6mL
mix, and add distilled water (100mL)
c) Final working stain solution
Ponceau-fuchsin solution	5-10mL
Azophloxin	2mL
0.2% acetic acid solution	88mL

3. Light Green Solution

Light Green	1g
acetic acid	1mL
Mix, and add distilled water (500mL)

4. Phophomolybdic acid-Orange G solution

Phosphomolybdic acid	3g
Orange G	2g
Dissolve in 500mL of distilled water and add crystal thymol.

Von Kossa Stain

1% aqueous silver nitrate

2.5% sodium thiosulfate

1% safranin O

Alcian blue stain

Alcian blue 8GX	1g
3% acetic acid solution	100mL

Hemotoxylin and Eosin stain

a)Harris’s hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5g
Absolute alcohol	25mL
Potassium Alum	50g
distilled water	500mL
mercuric oxide	1.25g OR
Sodium iodate	0.5g
Glacial acetic acid	20mL
b) Eosin solution
Commercially produced Eosin was used.

All stain dye powders are Gurr dye powders.
All reagents are analytical reagents, and not Lab reagents

Fluorochromes

Manufacturer	Fluorochrome	Catalogue Number
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcein Green	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarin Complexone	A3882
Intervet Australia, Victoria	Oxytetracycline (off the shelf antimicrobial drug)	Tradename; Engemycin 100